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碱性成纤维细胞生长因子对培养的骨骼肌细胞生长作用的研究

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维普资讯 http://www.cqvip.com ・2862・ 中国临床康复2002年1O月第6卷第l9期Chinese Journal of Clinical Rehabilitation,Octo ̄r 2002,Vol 6,No.19 呈均质红染的无结构物质,核染色消失。再灌流4周:海! 区细 胞坏死溶解。再灌流6周:海马区阳性细胞略增多,但仍少于3 d 时改变。再灌流各组阳性细胞计数与对照组行t检验存在明显 差异(P<0.01),见图l、2。 马CAl区神经元死亡,提示此类细胞死亡过程中伴有蛋白质合 成增加,而这与以往的神经元坏死过程中的蛋白质分解完全 同.进而推断缺血再灌流后神经尢的死亡:不是坏步匕,住后来的 脑缺血摸型研究中,均观察到梯彤DNA电泳条带,这 坏步E细 胞出现涂片状DNA电泳截然不同,说明在缺血后神经细胞的死 存在细胞凋亡I 。在大鼠全脑缺血模型中发现,缺血12 rain 2.3 流式细胞仪(FCM) 重复缺血再灌流3 d海马CAl区神 经细胞凋亡 分率最高,随重复缺血再灌流时间的延长,凋 神经细胞酉分率渐下降,至6周达最低点,与假手术组差异有 显著性意义(P<O.O1)。 3讨论 后第l天出现梯形DNA电泳带,至第3天达高峰,持续1周” , 而无1)NA随机降解所表现的涂片状电泳。而在断头造成的水久 性脑缺血模型中规察到断头后6 h叮见模糊的梯肜带,12 h后 梯彤带开始变淡,至24 h DNA随机降解,出现涂片状DNA电 缺血再灌流小鼠神经细胞凋亡检测及评价细胞凋亡形,奈 学特征是DNA的片断化、凋亡小体的形成,ca“、Mg。 依赖的内 源性核酸内切酶被激活,造成DNA核小体问的断裂,DNA单链 断裂。细胞发生凋亡是个主动的,錾因的过程,各个细胞发 生凋亡足散在的,非同步进行的,凋亡:发牛的进程非常短暂,仅 泳…。采用全脑重复缺血再灌流方式,通过原位未端标记法观 察海马区DNA片断。而海马区早期小胶质细胞标记阳性,至 1~3 d阳性细胞标记明显增多,结果进・步证实了在缺血再灌 溉脑组织中细胞死亡足以细胞凋亡为t要死亡形式。在对照组 在几分钟至十几分钟内便完成,义随即被附近的吞噬细胞吞 噬。因此,观察细胞彤态最常用的光学和电子显微镜 能x寸凋 的标记检测中电町见到敞在的、少量的阳性细胞,电证明了细 胞凋亡存在于正常脑神经细胞中, 是发生率较低l L三。 (图1—2见封二) 细胞和凋亡小体进行定量研究,既使定性研究电缺乏足够的 灵敏度。凝胶电泳检测DNA片断化后形成185 bp倍数的梯彤 参考文献: 条带电因其灵敏感度低,背影 清晰,且同挂微镜观察一样难 以定量而具有局限性。 本研究采用原位末端标记于段x,t细胞凋亡进行定性研究, 采用流式细胞仪对细胞凋亡进行定 研究 ,实验结果显示此 【1】钱佳利,徐忠信,徐利军,等.人鼠全脑缺血再灌注损伤过程中细 胞凋亡研究【J】.现代康复,2001,5(6上):60—61. 【2】张秋玲,邢国庆,孟庆华,等.氟桂嗪对沙鼠脑缺血再灌注损伤后 行为及海马形态学改变的影响【J】.现代康复,2001,5(9上):45~46. 【3】SCI Y,VON LUBTZ D,BASILE AS,et a1.1ntemucleosomal DNA fragmentation in gerbil hippecampus following forebrain ischemia【J J. Neurosci Lett.1994.17l:179—182. 种方法特异、灵敏、准确、可行,既有形态学又有结构学的特征, 同时佐以定量分析,因此证明是细胞凋[ 变化。神经细胞凋£: 是缺血再灌流后神经细胞死亡的j三耍形式。Wyllie AH等住埘 小鼠全脑缺血性研究时发现蛋白质合成抑制剂能减少小鼠海 【41RENDS MJ,WYLL1E AH.Apoptosis:Mechanisms and roles irrpatbol- ogy【J】,Pathology,1991,32:223—362. (收稿日期:2002—07—04) (编辑:蒋朝利) 康复相关基础研究 碱性成纤维细胞生长因子对培养的骨骼肌 细胞生长作用的研究 马 焰,高 伟,孙月芬,赵 民(北京军医学院,北京100071) ・论著・ 摘要:目的 观察碱性成纤维细胞生长因 (bFGF)X,t体外培养的新生Wistar大鼠骨骼肌细胞存活、分化及促增殖影响 方 法果应用无血清培养技术,采用四唑盐(MT1、)微量比色法,乳酸脱氢酶(LDH)活性、肌酸磷酸激酶(CK)活性测定及蛋白定鞋检测n结 bFGF干预组M1Tr微量比色的AOD值、LDH活性、CK活性及蛋白质合成均高于对照组 结论外源性bFGF明显促进细胞的存 活、生长及增殖分化。 关键词:碱性成纤维细胞牛长因子;骨骼肌细胞;乳酸脱氧酶;肌酸激酶 中图分类号:R68l q 文献标识码:A 文章编号:1671—5926(2002)19—2862—02 Effects of basic fibroblast growth factor on cultured skeletal muscle cells in neonatal rats MA Yan.GA0 Wei,sUN Yue-fen el n1.Be ng Military Medical College.Be ng 100071.China Abstract:0bjective To observe the effects of basic ifbroblast growth factor(bFGF)on the 8urvIval and growth of neonatal rats skeletal muscle ceUs in culture.Method Bv the MTT eolorimetric microassay,the activity of LDH and CK and the quantitative of protein we de‘ termined.Result The A OD of M1T microassa ̄and the protein content were raised as bFGF increased in the medium serum free.The LDH and CK effiux assav also showed that activitv were raised as bFGF concentrated in the medium.Conclusion The results indicate that bFGF has important effects on survival proliferation and differentiation of skeletal muscle cells. Key words:bFGF;muscle cell cultures;lactate dehydrogenase;creatine kinase 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, 的新生大鼠骨骼肌细胞生长、发育的影响,以探讨bFGF对肌细 bFGF)是由146个氨基酸组成的活性肽,,‘。泛存在于生物体内, 对起源于中胚层、神经外胚层组织和细胞的存活、生长及促增 胞损伤防治作用的可行性。 l材料与方法 殖、分化具有明显的生物效应” 该研究旨在应用外源性bFGF,观察其对体外(in vitro)培养 基金项目:全军“九五”医学科研基金资助项目(98Ml1 8) 作者简介:马焰(1949一),女,安徽金寨人,主任医师,教授,硕士,研 1.1材料DMEM培养基、新生牛血清(FBS)、胰蛋白酶、ED— TA、牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮畔盐(MTI、)等购自Gibco、 Sigma、Direo及FIuka公司;蕾组人碱性成纤维细胞牛长 (rh—bFGF)系基因工程产品,由北京双骘生物技术 限公 d提 供;新生大鼠由军事医学科学院动物所提供。 究方向为神经肌肉病及骨骼肌细胞凋亡等。 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国IIai床康复2002年l0月第6卷第l9期Chinese Journal of Clinical Rehabilitation,October 2002,Vo1.6,No.19 ・2863- ・本文提示・ ・外源性bFGF对骨骼肌卫星细胞和成肌细胞存活、 生长、促增殖及分化有显著影响。 理,多在l0、20 ng/ml组出现显著差异。组间差异显示40、80与 20 ng/ml组无显著性差异,见图1、表1。 3讨论 , 骨骼肌损伤后的再生和修复主要来自于肌1王星细胞的激 1.2细胞培养及bFGF干预无菌取乍后3 d内的Wistar人鼠 活及成肌细胞的增殖与分化 。现已证实,骨骼肌细胞中不仅 存在有bFGF特异性受体,而且本身也合成和分泌bFGFI J。 bFGF住哺乳类动物体内同时是形态发生原、促有丝原 及分化因子,抗bFGF抗体能封锁成肌细胞的有丝及分 化II 。因此,在肌卫星细胞活性和成肌细胞的增殖与分 后肢肌肉,经胰蛋白酶消化分离,用差速贴壁法去除非成肌细 胞 待卫星细胞(satellite cells,SCs)分化为成肌细胞(myoblast) 时,以l×10 /ml细胞密度转种 96扎板,孵育2 d,换0.04% FBS的培基48 h以细胞同步化j:Go期 然后用含不同浓度的 bFGF(0、5、10、20、40、80 ng/m1)的无血清培基继续培养48 h 后检测。 1.3 细胞增殖检测 采用M rr微量(M_rr,5 ng/m1)比色法检 测细胞增殖状态。 1.4 细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性、肌酸激酶(CK)活性测定 化方面,bFGF应具有重要影响,本研究结果证实了这一结论。 该实验采用无血清培养技术,已有效排除了血清中诸多未知因 素的干扰。MTr检测结果表明,bFGF明显促进成肌细胞的增 殖,10 ng/ml以上组即有显著差异,这与国外有关报道结果一 致 J。LDH活性测定表现出呈bFGF浓度依赖性增高,20 ng/ml 无血清DMEM培基培养48 h的细胞,吸尽培养液,用D-Hank 液洗两遍,每扎加入PBS 50 1,经一30℃反复冻融3次后,分 别测定LDH、CK的活性(H立7l50型全自动生化分析仪)。 以上组有极显著差异,表明bFGF不仅对成肌细胞有明显促增 殖作用,而且埘肌细胞存活也有明显作用。 蛋白质测定结果显示,bFGF能明显促进成肌细胞蛋白质 的合成。5 ng/ml组即有显著作用。骨骼肌细胞含有多种蛋白 质,该实验检测的仅足肌细胞总蛋白质含量,对于肌细胞重要 功能蛋白质含量测定,尚有待进一步研究。b F与肌细胞膜上 特异性受体结合,激活酪氨酸激酶,导致DNA大量合成,应为 蛋白质含量明显增加的重要因素之 。 CK活力表达了体外培养肌细胞的分化能力12 J。该研究结果 1.5细胞蛋白质含量测定细胞经上法冻融后,以BSA作抓准, 采用考马斯亮蓝(eoomassie BB)比色法测定细胞蛋白质含量。 1.6统计学处理实验数据用Excel软件分析,实验结果以 (i±s)表示,组问差异用t检验。 2结果 2.1 bFGF对细胞增殖的影响 M1Tr法测,定各组光密度,均值 娃示,其△OD值随bFGF浓度增大而增高,表明外源性bFGF明 促进成肌细胞的增殖,见图l。 表明,与对照相比,bFGF 10 ng/ml以上各组CK活性表达均有 显著性增高,分析可能与外源性bFGF能激活肌卫星细胞向成 肌细胞分化,并促使成肌细胞大量增殖有关。 趔 0 有关bFGF最佳效应浓度各家报道不一。该实验结果表明, 0 q }ⅡIjI_¨ 0 5 在20 ng/ml浓度取得了较好效应,40、80 ng/ml组经统计学处 理,与20 ng/ml组无显著性差异。 近期研究发现,缺血、缺氧、创伤等因素常导致骨骼肌内源 性bFGF含量减少 ・ 。因此,应用外源性bFGF促进损伤后肌细 胞的再生和修复应具有积极的防治作用 -9}。 参考文献: ¨l LIU L NICOLI CS.Evidence for a role of basic fibroblsta growth factor in rat embryonic growth and diferentiation【J】、Endocrinolgy,1988,123: 2027. 10 20 40 80 bFGF(ng/m1) 注:与对照组相比, P<0 05,一P<0.0l,与5 ng组相比 P<0.05 图l 不同浓度bFGF对骨骼肌细胞增殖的影响 2.2 bFGF对细胞LDH活性、CK活性的影响LDH为 胞质 酶,在肌细胞中含量阜富。细胞经冻融裂解后,LDH自细胞内溢 出 存活的细胞数越多,则LDH活性越高。CK由肌细胞线粒体 产, ,其活力表达了体外培养的肌细胞的分化能力 I. 本研究 结果表明,用bFGF干预48 h的培养成肌细胞,L1)H活性和CK 活性呈bFGF浓度依赖性增高.见表l。 【2】马焰,沈定国,朱克.正常人和Dueheane肌营养不良肌细胞培养的 研究lJ】.中华神经精神杂志,l993,26(4):259. 【3】AUDERs0N JE,MITCHELL DM,MCGEACHIE JK,et a1.The time course of basic fibreblast growth factor expression in crush.injured 表1 不同浓度bFGF对肌细胞LDH、CK、蛋白质含量的影响 ±s) skeletal muscles of SJL/J and BALB/C micelJ】.Exp Cell Res,l995, 2l6:325. 一 【4】YAMADA S,BUFFINGER N,DIMARIO J,et a1.Fibroblsta growth factor is stored in fiber extracellular matix and rplays a role in regulating muscle 注:与对照组相比, P(0.05,一P(0.0l:与5 ng/ml组相比, P(0.05, P(0.Ol;与l0 ng/ml组相比, P(0.05, P(0.0l 2.3 bFGF对细胞蛋白质合成的影响 与埘照组相比,bFGF 5 hypertophy rlJ】.Med Sci Sports Exercise,1989,21:l 73. 【5 lGU rHRIDGE M,W11鼬N M,C0WI lNG M,et a1.The role of basic fi- breblsta growth factor in skeletal muscle regeneration【J】.Grewth Fac- tots,l992,6(1):53. 【6】HODIK V,ME33"A,HALEVY O.Mutual effects of growth hormone and growth factors on avian skeletal muscle satellite cells[J】.Gen Cornp Enkoerinol,1997.108(1):161. 【7】FU XB,YANG YH,LI XK,et a1.1schemia and reperfusion impair the gene expression of endogenous basic fibreblast growth(bFGF)in rat ng/ml组即有明显差异(P(0.05),l0 ng/ml以上各组有显著 差异(P(0.01),见表l。表明bFGF对肌细胞蛋白质的合成有 显菩促进作用。 2、4不同浓度bFGF对肌细胞生长发育的影响 与埘照组相 skeletal muscles[J】.J Surg Res,1998,80:88. 18】杨琳.生物活性因子在周围神经损伤修复中的应用【J】.现代康复, 2000.4(10):1458—1459. 19】徐剑文.成纤维细胞生长因子与缺氧缺血性脑损伤研究新进展【J】. 现代康复,2001,5(6上):74—75. (收稿日期:2002—03—27)(编辑:蒋朝利) 比,bFGF各浓度在4项检测中均商] 埘照组,但经统计学处 

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