酶促DNA合成研究的进展
【摘要】随着生物科技的快速发展以及基因工程研究的需要，DNA的合成越来越受到各界的重视，传统的合成方法已不能完全满足发展的需要，如今酶促DNA成已走上舞台，因其对DNA合成的高效性，它已成为新世纪科学家们研究的对象。本文将详细介绍酶促DNA合成研究的进展，并指出DNA聚合酶的分离提纯方法，以及其合成DNA的原理。
【关键词】DNA聚合酶；DNA合成；进展
0.引言
酶促DNA合成发展史上最重要的一位人物莫过于科恩伯格了，他与她的同事完成了从合成核苷酸到最终合成DNA的所有历程，并发现了对于合成DNA起到关键作用的DNA聚合酶，随后他有掌握了DNA聚合酶的分离提纯技术，从而向世人展示了DNA合成的化学机理。也因此，他于1959年获得了诺贝尔生理或医学家，为DNA的合成奠定了基础，为生物科技和世人作出了杰出贡献。下文将就酶促DNA的合成研究进展作详细阐述。
1.DNA合成技术
1.1微阵列介导DNA合成技术
相比于过去商业化DNA合成常用到的solid-phase phosphoramiditechemistry引物合成技术，因其化学反应速率问题，该法合成的寡核苷酸只能作为原材料来使用，加之其高额的成本已经不在普遍使用了，如今微阵列法因其在技术通量和成本上的优势以及试剂消耗量少的缘故正被广泛用于DNA的合成中，然而该法也存在没有有效简化下游DNA
合成过程中所消耗成本的问题。
1.2酵母体内的DNA合成技术
随着DNA合成技术的不断发展，相比于体外合成技术，DNA的体内合成技术也因其特性为不少科学家所关注，Venter 研究所的Gibson 团队探索了酵母体内 DNA 合成方法，并取得了显著成果。以下实验可证明DNA在酵母体内合成是可行的：在单个酵母细胞例摄取全部重叠区域的必需核苷酸链条，以及与末端寡核苷酸链有重叠区域的线性化载体，然后在核内对这些片段进行组装合成[1]。
1.3连接介导DNA合成技术
连接介导DNA合成技术目前在一些商业化基因合成中仍占有一定地位，是因为其拥有简单易用和较低基因突变率的原因。连接介导DNA合成法的原理是利用DNA连接酶将寡核苷酸连接起来形成比较长的基因。77 bp 的编码酵母丙氨酸转运 RNA 的基因就是于1970年由 Khorana 利用DNA连接酶首次合成的，近年来，耐热DNA连接酶的发现，LCR反应的进一步发展，基于LCR的DNA组合技术越来越简便，耐热连接酶因其提高了连接温度 (50~65 ℃ )，有效的减少了二级结构的存在。
2.DNA聚合酶的提纯分离
酶作为人体内所有化学反应的高效催化剂，它控制着整个机体，因此，仅仅是一个酶的功能发生异常都可能导致极大的危害，酶是一种由多个氨基酸排列组合而成的大分子蛋白质，它具有催化性、高效性、高度特异性三个重要特点[2]。要分离提纯DNA聚合酶首先要找到拥有DNA聚合酶的资源，研究发现，大肠杆菌含有丰富的DNA聚合酶，它也被广
泛用于DNA聚合酶的分离提纯试验。酶的提纯可以分为以下几步：
第一步首先是提取物的制备。通常使用的是声波提取的方法，因该法可以获得较高的DNA聚合酶产量，在甘氨酸缓冲剂中注入大肠杆菌细胞使其悬浮与试剂中，然后用超声振荡器将细胞震裂，接着对悬浮液进行离心分离操作，最后将不透明的上清液收集起来并测定各级分蛋白质的含量，做好记录。第二步是链霉素的沉淀。主要步骤是用20%的蛋白质包含80%的DNA聚合酶活性，再利用链霉素的高选择性来沉淀核蛋白。经过链霉素沉淀后，再次进行离心分离处理，最后获得上清液和沉淀物，经测定，其中，上清液中有酶S，沉淀物中有酶P。第三步是DNA酶的水解。取上步实验所得上清液，加入DNA酶进行反应，在DNA酶的催化作用下大量蛋白质析出。第四步是利用矾土凝胶的吸附性和洗脱作用。取前一步骤所得上清液，加入矾土凝胶，分别进行搅拌和离心分离操作，最后再用磷酸钾缓冲剂冲洗掉凝胶，得到洗脱物，将洗脱物浓缩处理，然后分别进行硫酸铵分馏和二乙基氨基乙烯纤维素分馏等，最终可获得拥有活性且纯度极高的DNA聚合酶。DNA聚合酶的发现和分离提纯，以及后来其对DNA合成研究的重要作用，被认为是酶促DNA合成研究史上的重大突破。
3.DNA合成的化学机制
DNA合成的化学机制主要是：理解核苷酸和核苷三磷酸的合并，同时对这些概念和方法达到掌握的程度。科恩伯格认为DNA合成必需的四种物质：即 dATP, dGTP,dC其合成方程是：
DNA的合成中主要反应是ATP, TTP, GTP, CTP的5’核苷磷酸基活性为基础的合成机制[3]。其被认为是由核苷酸的3‘羟基基团亲核攻击核苷三磷酸内部的磷酰基基团而发生的缩合反应，由此造成单体核苷酸与被攻击的基团相结合，同时将无机焦磷酸排出。实验研究发现活性脱氧核苷-5’-磷酰基事故DNA合成的基本单位。DNA链的延伸机制是缩合反应，如下图所示。
4.结语
随着DNA技术的广泛应用，比如说在密码子优化、代谢工程和基因组合成等方面，DNA的合成研究的重要性越来越为人所了解，尤其是DNA聚合酶的发现及分离提纯后，相信在不久的将来酶促DNA合成研究将会取得更好的进展。
【参考文献】
[1]向义和.酶促DNA合成研究的进展[J].自然杂志，2011，,3（4）：231-238.
[2]王霞，赵娟，李柄志，程景胜，元英进.DNA合成技术及应用[J].生命科学，2013,25（10）：994-999.
[3]冯森，王璐，田敬东.基因合成技术研究进展[J].生物工程学报，2013,29（8）：
1075-1085.
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