(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108169494 A(43)申请公布日 2018.06.15
(21)申请号 201810141218.7(22)申请日 2018.02.09
(71)申请人 广东优尼德生物科技有限公司
地址 523000 广东省东莞市东莞松山湖高
新技术产业开发区台湾高科技园桃园路1号莞台生物技术合作育成中心3栋4楼(72)发明人 夏宣喜 赖华 孔浩杰 刘志文 (74)专利代理机构 深圳市世纪恒程知识产权代
理事务所 44287
代理人 胡海国 徐进之(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)G01N 33/92(2006.01)
权利要求书2页 说明书9页 附图2页
CN 108169494 A(54)发明名称
一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法(57)摘要
本发明公开一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的
硝酸纤维素膜、耦合胶体金试纸条包括PVC衬板、
物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。本发明的检测脂联素的胶体金试纸条具有方便快捷，操作简单，耗时较短，便于临床推广应用等优点。
CN 108169494 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，其特征在于，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；
所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。
2.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
3.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；
用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；
将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；
再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。4.如权利要求3所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
5.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
6.如权利要求5所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08:0.08:15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围
2
CN 108169494 A
权 利 要 求 书
2/2页
为10nm～11nm。
7.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。
9.如权利要求8所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述梯度质量浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L。
10.一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；
利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片上；
待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。
3
CN 108169494 A
说 明 书
一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法
1/9页
技术领域
[0001]本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法。
背景技术
[0002]脂肪组织(adipose tissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。正常人血清中脂联素的浓度范围在3～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％，不随饮食或昼夜节律而改变，女性血清中的脂联素含量大于男性。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。[0003]而现有技术中一般采用酶联免疫分析试剂盒来检测脂联素浓度，虽然酶联免疫法检测的准确度较高，但是该方法检测过程繁琐，耗时较长，且样本需要批量检测，不适用于及时检测。
发明内容
[0004]本发明的主要目的是提出一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，具有方便快捷、操作简单、耗时较短的特点。[0005]为实现上述目的，本发明提出的检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。[0006]优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
[0007]优选地，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
[0008]分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
[0009]将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；[0010]用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；
4
CN 108169494 A[0011]
说 明 书
2/9页
将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试
带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；
[0012]再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。[0013]优选地，所述样本稀释液包括磷酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
[0014]所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。[0015]优选地，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0016]将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；[0017]利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
[0018]将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0019]将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0020]优选地，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08:0.08:15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm～11nm。[0021]优选地，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。[0022]优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。[0023]检测信号值。[0024]优选地，所述梯度质量浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L。
[0025]本发明还提出一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0026]采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；[0027]利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片上；
[0028]待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。
[0029]本发明提供了一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫
5
CN 108169494 A
说 明 书
3/9页
片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。与现有技术相比，本发明的检测脂联素的胶体金试纸条具有方便快捷，操作简单，耗时较短，便于临床推广应用等优点。附图说明
[0030]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0031]图1为本发明检测脂联素的胶体金试纸条一实施例的结构示意图；[0032]图2为本发明检测脂联素的胶体金试纸条又一实施例的结构示意图；[0033]图3为本发明检测脂联素的胶体金试纸条另一实施例的结构示意图；[0034]图4为图3中第一纤维膜层与第二纤维膜层的结构示意图。[0035]附图标号说明：
[0036]
标号102020a20b2122
[0037]
名称标号名称PVC衬板23引流槽硝酸纤维素膜30偶合物结合垫片第一纤维膜层40样本垫片第二纤维膜层50吸水垫片第一层析部60测试带第二层析部70控制带
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0038]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]本发明提出了一种检测脂联素的胶体金试纸条。[0040]参照图1，本发明提出的检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40。所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体。所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。[0041]其中，胶体金试纸条检测原理是让待测样本通过耦合物结合垫片30，与耦合物垫片上包被的胶体金标记脂联素抗体特异性结合，结合物在硝酸纤维素膜20上层析到达包被
6
CN 108169494 A
说 明 书
4/9页
有鼠抗脂联素抗体区域后，脂联素-胶体金标记脂联素抗体复合物被脂联素抗体捕获，待测样本中脂联素浓度越高，测试带60光密度值越高；游离的胶体金标记脂联素抗体继续层析至控制带70区域，并与控制带70抗体结合，通过仪器检测测试带60和控制带70的信号值，即可定量待测样本中脂联素的浓度。[0042]具体地，所述测试带60位于所述硝酸纤维素的左侧，所述控制带70位于所述硝纤维素的右侧，所述测试带60与所述控制带70之间的距离为3mm～7mm。优选地，所述测试带60与所述控制带70之间的距离为5mm。
[0043]所述硝酸纤维素膜20的厚度为0.3cm～0.5cm，所述硝酸纤维素膜20的宽度为0.2mm～0.4mm。优选地，所述硝酸纤维素膜20的厚度为0.4cm，所述硝酸纤维素膜20的宽度为0.3mm。另外，所述硝酸纤维素膜20的孔径为0.2um～5um。所述吸水垫片50为吸水纸垫、吸水纤维垫、吸水棉垫、吸水性树脂或复合吸水材料。[0044]参照图2，在一实施例中，所述硝酸纤维素膜20的厚度自靠近所述偶合物结合垫片30的一侧至靠近所述吸水垫片50的一侧逐渐减小。[0045]参照图3，所述硝酸纤维素膜20还可包括第一纤维膜层20a和第二纤维膜层20b，所述第二纤维膜层20b粘贴于所述PVC衬板10上，所述第一纤维膜层20a粘贴于所述第二纤维膜层20b上，所述测试带60和所述控制带70均设置于所述第一纤维膜层20a上。[0046]进一步地，为了提高所述硝酸纤维素膜20的层析能力，参照图4，所述第一纤维膜层20a包括间隔设置的第一层析部21和第二层析部20b，所述第一层析部21、所述第二层析部22与所述第二纤维膜层20b共同围设形成引流槽23，所述引流槽23的槽宽朝向靠近所述吸水垫片50的方向呈渐缩设置。[0047]在上述各实施例中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：
[0048]分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体；用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液；将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘干。
[0049]具体地，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。[0050]在上述各个实施例中，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0051]将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进
7
CN 108169494 A
说 明 书
5/9页
行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0052]具体地，所述样本垫片40为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。[0053]优选地，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08:0.08:15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm～11nm。[0054]在本实施例中，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。优选地，所述梯度质量浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L。[0055]在一较佳实施例中，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片40处，所述检测窗口位于所述测试带60和所述控制带70处。
[0056]本发明检测脂联素的胶体金试纸条操作简单，检测耗时2min，且其测试误差为5％，相对偏差为10％，检测的最低浓度低至10ug/mL，线性范围为0.5～40ug/mL。因此，与现有技术相比，本发明提供的检测脂联素的胶体金试纸条方便快捷，准确度高，精密度好，灵敏度高，此外，该检测脂联素的胶体金试纸条有利于进行临床推广应用，特别适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用。
[0057]本发明还提出一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其中，该检测脂联素的胶体金试纸条采用上述全部实施例中制备的胶体金试纸条。所述检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法包括如下步骤：[0058]采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。需要说明的是，所述血样可以为血清、血浆或者全血。所述样本稀释液为含0.2％Tween-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，样本稀释液的pH值为6.5～6.7。[0059]为了进一步对本发明进行解释，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。[0060]实施例1
[0061]一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。[0062]其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：[0063](1)抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以6000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。
8
CN 108169494 A[0064]
说 明 书
6/9页
(2)用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被
液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263份，KH2PO4 1.000份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份。其中，质量分数为2％的吐温-20水溶液为将2ml的吐温-20加入到998ml蒸馏水中配置而成。[0065](3)将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
[0066]所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0067](1)将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.080∶0.080∶15.84配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm～11nm。[0068](2)利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8。[0069](3)将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0070](4)将0.27mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0071]所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。[0072]一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：[0073](1)采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；(2)利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；(3)待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5％，相对偏差为10％。[0074]实施例2
[0075]一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。[0076]其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：[0077](1)抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以10000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透
9
CN 108169494 A
说 明 书
7/9页
析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。[0078](2)用pH值为6.6的磷酸盐缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.376份，KH2PO41.109份，NaCl6份，KCl 0.2份，蒸馏水1000份。其中，质量分数为2％的吐温-20水溶液为将2ml的吐温-20加入到998ml蒸馏水中配置而成。[0079](3)将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
[0080]所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0081](1)将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.055∶0.055∶15.88配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm～11nm。[0082](2)利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.9。[0083](3)将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0084](4)将0.28mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0085]所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。[0086]一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：[0087](1)采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；(2)利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；(3)待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5％，相对偏差为10％。[0088]实施例3
[0089]一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。[0090]其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：[0091](1)抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以
10
CN 108169494 A
说 明 书
8/9页
13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。[0092](2)用pH值为6.5的Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6份，KH2PO42.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。[0093](3)将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
[0094]所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0095](1)将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035∶0.035∶15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm～11nm。[0096](2)利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为7.1。[0097](3)将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0098](4)将0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0099]所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。[0100]一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：[0101](1)采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；(2)利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；(3)待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5％，相对偏差为10％。[0102]实施例4
[0103]一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板10、硝酸纤维素膜20、耦合物结合垫片30、样本垫片40及吸水垫片50，所述PVC衬板10上粘贴有硝酸纤维素膜20，所述硝酸纤维素膜20的一端粘贴有耦合物结合垫片30，另一端粘贴有吸水垫片50，所述耦合物结合垫片30上粘贴有样本垫片40；所述硝酸纤维素膜20上设置有测试带60和控制带70，所述测试带60内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带70内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片30包被有胶体金标记脂联素抗体。[0104]其中，所述硝酸纤维素膜20按如下步骤制备：[0105](1)抗体的纯化。分别将测试带60抗体原液和控制带70抗体原液在4℃下以
11
CN 108169494 A
说 明 书
9/9页
13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带60抗体和控制带70抗体。[0106](2)用pH值为6.5的Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带60包被液和0.8mg/ml控制带70包被液。所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷5.5份，KH2PO43.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。[0107](3)将所述测试带60包被液和所述控制带70包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜20对应的测试带60和控制带70位置，喷涂量为1μL/cm；再将包被好硝酸纤维素膜20置于37℃温度下烘烤4h，即可得到包被好的硝酸纤维素膜20。
[0108]所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：[0109](1)将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035∶0.035∶15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～11分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。其中，该胶体金液的颜色由黑→蓝→紫→红色时即成，胶体金颗粒直径为10nm～11nm。[0110](2)利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为7.1。[0111](3)将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0112](4)将0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。[0113]所述耦合物结合垫片30的包被：将胶体金标记脂联素抗体用PBS溶液稀释16倍后，再将稀释后的胶体金标记脂联素抗体均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷涂量为25μL/cm，于37℃温度下烘烤干燥4小时，制得包被有胶体金标记脂联素抗体的耦合物结合垫片30。[0114]一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，包括如下步骤：[0115]采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；(2)利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片40上；(3)待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带60信号值和控制带70信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，即可定量判定其质量浓度。本实施例的检测脂联素的胶体金试纸条，检测耗时2min，且其测试误差为5％，相对偏差为10％。
[0116]以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
12
CN 108169494 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
13
CN 108169494 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
图4
14
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容