11月13日
引物合成的详解
4.需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用
一般PCR扩增
引物长度要求
纯度级别要求
<45 base >45 base < 40base 20base左右 根据实验要求定 根据实验要求定 根据实验要求定
OPC PAGE OPC, PAGE OPC
OPC, PAGE，HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC
一般PCR扩增 诊断PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变等
基因构建（全基因合成） 反义核酸
修饰引物
根据实验要求定
8.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成
10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml.
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9.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为
25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G +
C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 12.如何保存引物？
答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 13.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷
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酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。 16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？ 答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。 ◆G-C含量控制在40-80%左右。
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◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ◆在引物的5’端避免使用G。 ◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。 有用的荧光染料参数
Name
吸收波长 发射波长
colors 6-FAM （6-carboxy-fluorescein） 494nm 518nm Green TET （5-tetrachloro-fluorescein） 521nm 538nm Orange HEX （5-hexachloro-fluorescein） 535nm 553nm Pink TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine） 560nm
582nm Rose ROX （6-carboxy-x-rhodamine） 587nm 607nm Red Cy3 （Indodicarbocyanine） 552nm 570nm Red Cy5（Indodicarbocyanine）
643nm
667nm
Violet
20.Primer设计的基本原则是什么？ 答：引物设计的下列原则供您参考。 ◆引物长度一般在18-35mer。 ◆G-C含量控制在40-60%左右。 ◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 ◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么
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会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
A260/280 2.50 1.85 1.15 1.14 1.66
22.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？
答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
23.引物不纯会有什么后果？
答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
24.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不
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好了？
答：如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。 25.PCR扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。
16:14 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日志 保护碱基列表 Enzyme
Oligo Sequence
Chain % Cleavage
Length 2 hr 20 hr
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AccI
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 0 0 0 0
AflIII
8 0 0 10 >90 >90 12 >90 >90 8 >90 >90 10 >90 >90 12 >90 >90 AscI
AvaI
BamHI
BglII
BssHII
BstEII BstXI
ClaI
EcoRI
HaeIII
HindIII
KpnI
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CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA GGGT(A/T)ACCC
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG
8 50 10 >90 12 >90 8 10 10 >90 12 >90 8 0 10 75 12 25 8 0 10 0 12 50 9 0
22 0 24 25 27
25 8 0 8 0 10 >90 12 50 8 >90 10 >90 12 >90 8 >90 10 >90 12 >90 8 0 10 0 12
10 8 0 10 >90 12 >90 >90 >90 >90 25 >90 >90 0 >90 >90 0 0 >90 10 0 50 >90
0 0 >90 50 >90 >90 >90 >90 >90 >90 0 0 75
0 >90 >90
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MluI NcoI NdeI
GACGCGTC CGACGCGTCG CCCATGGG CATGCCATGGCATG CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC 8 10 8 14 8 10 12 18 20 0 0 25 50 0 0 50 75 0 0 0 0 0 0 0 0 75 >90 NheI
NotI
NsiI PacI
PmeI
PstI
PvuI
SacI SacII SalI
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GGGAATTCCATATGGAATTCCC
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA TGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA CGAGCTCG GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
22 75 8 0 10 10 12 10 12 0 16 10 20 10 24 25 28
25
12 10 22 >90 8 0 10 0 12 0 8 0 10 0 12 0 24
75 8 0 14 10 22 >90 24 >90 26 0 8 0 10 10 12 0 8 10 8 0 12 50 28 0 30 10 32
10 >90 0 25 50 0 10 10 90 >90
>90 >90 0 25 >90 0 25 50 >90
0 10 >90 >90 0 0 25 10 10 0 >90 0 50 75
-------------
ScaI SmaI
GAGTACTC AAAAGTACTTTT CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA GACTAGTC GGACTAGTCC 8 12 10 25 75 75
10 10 50 >90 >90 >90 6 0 8 0 10 10 12 >90 8 10 10 10 SpeI
CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG SphI
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT StuI
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT XbaI
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG XhoI
CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG XmaI
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
-------------
12 0 14 0
8 0 12 0 14
10 8 >90 10 >90 12 >90 8 0 10 >90 12 75 14 75 8 0 10 10 12
10 8 0 10 25 12 50 14 >90
50 50
0 25 50
>90 >90 >90 0 >90 >90 >90 0 25 75
0 75 >90 >90
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