分光光度法测定DNA的浓度和纯度

分光光度法测定DNA的浓度和纯度

【目标请求】：

懂得：分光光度法测定DNA浓度和纯度的道理;

控制：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技巧办法;

熟习：分光光度法测定DNA浓度和纯度的试验操纵步折衷留意事项.

【试验道理】：

前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的,在后续的DNA酶切.衔接及转化等试验中须要必定的浓度和纯度请求,是以要测定DNA的浓度和纯度.

测定DNA的办法平日有：紫外分光光度法;琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法）

（1）紫外分光光度法：

构成DNA的碱基均具有必定的接收紫外线特征,最大接收值在波长为250～270nm之间,腺嘌呤的最大紫外线接收值在260.5nm,胞嘧啶：267nm,鸟嘌呤：276nm,胸腺嘧啶：264.5nm,尿嘧啶：259nm.这些碱基与戊糖.磷酸形成核苷酸后其最大接收峰不会转变,但核酸的最大接收波长是260nm,接收低谷在230nm.这个物理特征为测定核酸溶液浓度供给了基本.在波长260nm紫外线下,10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡聚核苷酸为20μg/ml.可以此来盘算核酸

样品的浓度.

分光光度法不单可以或许肯定核酸的浓度,还可以经由过程测定在260nm和280nm的紫外线接收值的比值（A260/A280）估量核酸的纯度.DNA的比值为1.8,RNA的比值为2.0.若DNA比值高于1.8,解释制剂中RNA尚未除尽.RNA.DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值下降.270nm消失高接收标明有酚的干扰.当然也会消失既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情形,所以有须要联合凝胶电泳等办法判定有无RNA,或用测定蛋白质的办法检测是否消失蛋白质.紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液.

（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：

对于很稀的核酸溶液,可以用琼脂糖凝胶电泳法.溴化乙锭在紫外光照耀下能发射荧光,它拔出到DNA分子中形成荧光联合物,使发射的荧光加强几十倍,而荧光的强度正比于DNA的含量,将已知浓度的尺度样品作为电泳对比,就可以估量出待测样品的浓度.用量只须要5-10ng DNA即可,肉眼不雅察可检测0.05g-0.1g的DNA.该办法只是估量程度,别的还应斟酌DNA或RNA样品平分子大小与尺度对比中核酸分子的长度.

【仪器与试剂】：

重要仪器：紫外分光光度计.石英杯.离心管.微量移液器;

重要试剂：试验1提取的质粒样品.纯水.

【重要试验步折衷教授教养设计】：

汲取5µL DNA样品或4µL RNA样品,加水至1ml混匀后,转入分光光度计的石英比色杯中.假如样品很少,可以用0.5ml的比色杯,上述核酸样品与水的用量缩小一半.

先用1ml水对分光光度计校订为零点.

在260nm和280nm分离读出光密度,DNA样品的浓度我OD260 × 核酸稀释倍数 × 50/1000;RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000;浓度单位为μg/µL.按步调1的稀释方法,DNA或RNA的浓度（μg/µL）均为OD260的10倍;如OD260为0.1,则样品的浓度就为1μg/µL DNA或RNA.如许稀释倍数异常便于盘算.

若为DNA样品,OD260/OD280比值大于1.8,解释仍消失RNA,可以斟酌用RNA酶处理样品;小于1.6,解释样品中消失蛋白质或酚,应再用酚/氯仿抽提,用乙醚抽提后,以乙醇沉淀纯化DNA.RNA样品OD260/OD280比值小于2,也应当斟酌再用酚/氯仿抽提.

【试验留意事项】：

应用石英杯时要留意拿取办法,不要直接拿透光的那两个正面;

测量前要调零,测量不合样品时冲要洗石英杯;

准确开.关紫外分光光度计.

【思虑题】：

试验得出的数据是否合理？为什么？

假如试验测得A260/A280＝1.8,是否能解释提取的DNA样品异常纯净？为什么？