岭南现代临床外科2018年4月第18卷第2期LingnanModernClinicsinSurgery，Apr.2018，Vol.18No.2
LINC00475在肾癌中的临床意义及其对肾
癌细胞786⁃O的影响
陈海城，蔡宇弘，郑灶松，陈志良，谢文练*
［摘要］目的
探讨长链非编码RNALINC00475在肾癌中的表达情况及临床意义，并研究
LINC00475对肾癌细胞786⁃O增殖、迁移能力的影响。方法
通过qPCR方法检测LINC00475
在我院43对肾癌组织及癌旁正常组织中的表达水平。通过TCGA数据，分析LINC00475在肾癌中的表达水平，及其与肾癌患者临床指标、预后的关系。通过siRNA技术下调LINC00475，利用MTS法及Transwell法研究LINC00475对786⁃O增殖、迁移能力的影响。通过GSEA分析LINC00475在肾癌中可能参与的分子机制。结果
TCGA数据库肾癌组织及我院肾癌组织中，
LINC00475在肾癌中的表达明显高于癌旁正常组织。TCGA数据分析表明，LINC00475的表达与肾癌患者的临床分期（P=0.010）、M分期（P=0.022）呈正相关。Kaplan⁃Meier生存分析表明，高表达LINC00475的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达LINC00475的肾癌患者（Log⁃rankP=0.012）。下调LINC00475明显抑制786⁃O的增殖、迁移能力。GSEA分析结果显示在LINC00475高表达组中，与cyclinD1、VEGFA、WNT信号通路相关的基因集明显上调（NOMP<0.01，FDRQ<0.05）。结论LINC00475在肾癌组织中高表达，下调LINC00475可以抑制肾癌细胞786⁃O的
增殖、迁移能力。
［关键词］长链非编码RNA；LINC00475；肾癌；临床意义doi：10.3969/j.issn.1009⁃976X.2018.02.009
中图分类号：R737.11
文献标识码：A
ClinicalsignificanceofLINC0047inrenalcellcarcinomaanditseffecton786⁃OcellsCHENHaicheng，CAIYuhong，ZHENGZaosong，CHENZhiliang，XIEWenlian*
DepartmentofUrology，SunYat⁃senMemorialHospital，SunYat⁃senUniversity，Guangzhou510120，China.
Correspondingauthor：XIEWenlian，E⁃mail：wenlianxie@sina.com［Abstract］Objective
Toinvestigatetheexpressionandclinicalsignificanceoflongnon⁃coding
RNA（lncRNA）LINC00475inrenalcellcarcinoma（RCC），andanalyzetheeffectofLINC00475ontheproliferationandmigrationof786⁃Ocells.Methods
TheexpressionofLINC00475inRCCand
adjacentnormaltissueswasdetectedbyqRT⁃PCR.TheclinicalsignificanceandprognosticvalueofLINC00475inRCCwasanalyzedusingTCGAdata.LINC00475expressionwasdown⁃regulatedbytrans⁃fectingsiRNAinto786⁃Ocells.Later，theproliferationandmigrationof786⁃OcellsweredetectedbyMTSandtranswellassays.Finally，thepotentialmolecularmechanismofLINC00475involvedinRCCwasanalyzedbygeneenrichmentanalysis（GSEA）.Results
TheexpressionofLINC00475inRCC
tissueswassignificantlyhigherthaninnormaltissues.TheexpressionofLINC00475waspositivelyasso⁃ciatedwithtumorstage（P=0.010）andMstage（P=0.022）.Meanwhile，patientswithhigherLINC00475expressionhadashortersurvivaltimethanpatientswithlowerLINC00475expression.Moreover，knock⁃downLINC00475couldsignificantlyinhibittheproliferationandmigrationof786⁃Ocells.Finally，GSEArevealedthatthegenesetsassociatedwithcyclinD1，VEGFA，WNTsignalingpathwayweresignif⁃icantlyup⁃regulatedinLINC00475highexpressiongroup（NOMP<0.01，FDRQ<0.05）.Conclusion
基金项目：国自然科学基金（81472388、81672534）
作者单位：中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科，广州510120*通讯作者：谢文练，E⁃mail：wenlianxie@sina.com
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LINC00475wasoverexpressedinRCCandknockdownLINC00475couldinhibitedtheproliferationandmigrationof786⁃Ocells.LINC00475mightbeanimportantbiomarkerinRCC.［Keywords］LncRNA；LINC00475；renalcellcarcinoma；clinicalsignificance
肾细胞癌（renalcellcarcinoma，RCC）或称肾共43对肾癌组织及癌旁正常组织，所取癌旁正常癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿组织均距癌组织边界2cm以上。标本均来自于中瘤，占肾脏恶性肿瘤的80%~90%及成人恶性肿瘤山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科行肾癌根治性手的2%~3%，且其发病率及死亡率仍逐年上升。肾术，且病理诊断确诊为肾透明细癌的肾癌患者。癌对化疗、放疗不敏感，治疗肾癌的主要方法仍然患者术前均无进行放疗、化疗。所用标本均得到是手术切除［1］。但是，对于转移性肾癌，极少数患所在医院伦理委员会批准，且获得患者知情同意者可通过外科手术途径获得较长生存期［2］。因并签署知情同意书。此，探索肾癌发生、发展的分子机制，研究肾癌的1.1.3细胞株人肾癌细胞株786⁃O购自美国模式分子标记物，寻找高效的分子治疗靶点对于提高培养物集存库。
肾癌患者生存率具有重要作用。
1.1.4
试剂
LipofectamineRNAiMAX、RPMI1640
在人类基因组中，人们将碱基对大于200的不培养基购自美国Invitrogen公司；胎牛血清FBS参与编码蛋白的RNA称为长链非编码RNA（Long
购自美国Sigma公司；RNAisoPlus、逆转录试剂盒、NoncodingRNAs，lncRNAs）［3］。根据lncRNAs在基
荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司；引物合成因组中的位置，可将其分为正义lncRNAs、反义于上海捷瑞生物工程有限公司，LINC00475上游lncRNAs、双向性lncRNAs、基因内lncRNAs和基因引物：CGGAGACAGACCTGGACACT，下游引物：间lncRNAs（lincRNAs）五种。lncRNAs在多种肿瘤ATGTTCCAAAGTCGCAGCAC；β⁃actin上游引物为细胞中存在异常表达并扮演重要角色［4］。在肿瘤AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游引物为ACAT⁃中，lncRNAs可通过作为支架连接相关RNA、DNAGCCGGAGCCGTTGTCG。LINC00475特异siRNA或蛋白质、作为竞争内源性RNA竞争miRNA的结si#1序列：GCGACTTTGGAACATGAAT，si#2序列：合位点等作用调控靶基因的表达，行使着癌基因
CCTAGAACAGTGTTAGAAA，设计并合成于广州或者抑癌基因的作用［4，5］。
市锐博生物科技有限公司。lncRNAs在肾癌中的研究仍十分有限。我们1.2方法
发现长链非编码RNALINC00475在肾癌组织中1.2.1
收集临床标本
手术结束后立即收取肾癌
高表达，且与肾癌患者的预后呈负相关关系，但组织以及癌旁正常组织。所取癌旁正常组织均距目前并无关于LINC00475的任何报道。本研究旨癌组织边界2cm以上。组织标本取得后立即存放在分析LINC00475在肾癌中的表达情况及与患者于液氮中保存。临床指标的相关性，并在体外研究LINC00475对1.2.2
LINC00475表达水平检测
①提取RNA：
肾癌细胞增殖、转移能力的影响，利用基因集富取出标本，剪取绿豆大小的组织，利用液氮研磨法集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA）探讨研磨至粉末状，加入RNAisoPlus2mL后按照TrizolLINC00475在肾癌中可能参与的分子机制，希望能法提取RNA；②逆转录：按照逆转录试剂盒步骤为肾癌早期诊断和预后提供新指标，为肾癌治疗提对提取的RNA进行逆转录，逆转录程序为：37℃供新靶点。
15min，85℃5s。③荧光定量PCR：将逆转录所得1
材料与方法
的cDNA模板稀释10倍，按照荧光定量PCR的反应体系：SYBRGreenIMaster5μL，cDNA模板2μL，1.1
材料
上、下游引物各0.5μL，ddH2O2μL。反应程序为：
1.1.1TCGA数据库资料
下载TCGA数据库
95℃5s，56℃15s，72℃15s，共40个循环。（https：//gdc？portal.nci.nih.gov/）［6，7］中肾透明细胞
1.2.3
细胞培养
将786⁃O、ACHN细胞培养于
癌的数据。共有448例肾癌与67例癌旁正常组织RPMI1640培养基中，培养基含10%FBS、1%青霉的RNAseq数据以及对应的肾癌患者临床数据。素⁃链霉素混合液。放置于37℃、5%CO2培养箱中，1.1.2
临床肾癌组织
本文于2012~2017年收集
并取对数生长期细胞进行实验。
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1.2.4细胞转染待细胞长至对数生长期时，取细LINC00475是位于人类染色体9q22.31，chr9：胞接种于6孔板中过夜。细胞贴壁并长至50%~92141467⁃92159608，拥有4个外显子，转录本全长60%时，利用LipofectamineRNAiMAX并按照说明书2000bp。本研究通过比较TCGA数据库肾癌组织步骤将LINC00475的siRNA（si#1、si#2）以及阴性对及癌旁正常组织中LINC00475的表达量，发现在照序列（NC）转染进入细胞中，隔天换液。转染后LINC00475在肾癌组织中的表达明显高于正常组48h收取细胞进行细胞功能学实验或者提取RNA。织（P<0.05，图1A）。我们进一步在43对肾癌组织1.2.5
MTS法检测细胞增殖
取转染siRNA后48
以及配对的癌旁正常组织中进行验证。结果表h的肾癌细胞接种于96孔板，设为对照组（NC组）明，与上述结果一致，LINC00475在肾癌组织中高以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置3个复孔，每表达（P<0.05，图1B）。
孔加入含1000个细胞的100μL细胞悬浮液，分别于0h、24h、48h、72h、96h、120h加入MTS试剂2）GO5
P=1.359E⁃37
20μL，4h后利用酶标仪检测490nm处各孔的吸5（L7光值（OD）。并以此绘制生长曲线。400C0
1.2.6
克隆形成法检测细胞增殖
取转染siRNA
NILfo后48h的肾癌细胞接种于6孔板，设为对照组（NCnoiss组）以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置3个复e-5
rpxE孔，每孔加入含1000个细胞的2mL细胞悬浮液，evita14天后用4%多聚甲醛固定30min，再用0.1%结晶le-10
A
RNormal
Cancer
紫溶液进行染色40min，拍照后计算克隆形成的细胞群落个数LINC00475Expression
1.2.7
Transwell法检测细胞迁移
取转染siRNA
后48h的肾癌细胞接种于Transwell小孔，设为对50T）A照组（NC组）以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置N40oT3个复孔，每孔上室加入含5×104个细胞的200μLev30ital无血清细胞悬浮液，下室加入600μL含20%FBSeR20ge（的培养基。4h后用4%多聚甲醛固定30min，再10anhC用0.1%结晶紫溶液进行染色40min，拍照后计算d0B
loF穿过半透膜的细胞个数。-10
10
20
30
40
1.3
数据分析
图1LINC00475在肾癌中的表达情况A.TCGA数据分析
采用SPSS18.0.0软件进行统计分析。上述实LINC00475在肾癌组织和正常组织中的表达情况；B.LINC00475在43例肾癌组织和癌旁正常组织中的表达情况
验均重复3次，实验结果以x±s表示。LINC00475的表达量与临床特征的关系采用t检验，生存分析2.2LINC00475的表达水平与肾癌患者预后的相采用Kaplan⁃Meier法及log⁃rank检验。P<0.05为差关性
异具有统计学意义。GSEA通过JAVA程序运行［8］。我们再进一步分析LINC00475的表达与患者
GSEA芯片数据来自TCGA数据库，将LINC00475临床特征的相关性，并将结果整理于表1。可见，表达量最高的前20例作为高表达组，表达量最男性患者中LINC00475的表达量高于女性患者低的前20例作为低表达组，构建芯片表达谱数据（P=0.005），但与年龄无关。更重要的是，我们发集文件。功能基因集文件采用BioCartagenesets现LINC00475表达水平与患者肿瘤stage分期（P=（217个基因集）、KEGGgenesets（186个基因集）和0.010）、M分期（P=0.022）呈正相关。我们根据oncogenicsignatures（189个基因集），GSEA结果采LINC00475的表达量将448例肾癌患者分为高表用Cytoscape的图示表达。
达组（n=224）和低表达组（n=224）。利用Kaplan⁃2
结果
Meier法分析发现，高表达LINC00475的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达LINC00475的肾癌2.1
LINC00475在肾癌组织中高表达
患者（Log⁃rankP=0.012，图2）。
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表1
LINC00475表达水平与肾癌患者临床指标的相关性
*
特征例数
LINC00475的表达量（LOG2）
P值
4e⁃005
*
O性别⁃687男288-2.778ni3e⁃005
0.005*
5女
160-2.2497400年龄（岁）CN2e⁃005
IL<60205-2.449fon60243-2.4290.913
oiss1e⁃005
er病理分级pxEG1-2199-2.5840
G3-4243-2.2550.071NC
si#1
si#2
临床分期图3siRNA有效下调LINC00475的表达水平
stageⅠ-Ⅱ260-2.627stageⅢ-Ⅳ186-2.1520.010*明显抑制786⁃O的增殖能力，其抑制程度具有统T分期计学意义。我们进一步利用Transwell小室进行体T1-2276-2.567T3-4172-2.2320.074外的迁移实验，培养4小时后，与NC组相比，下调M分期LINC00475能够抑制786⁃O的迁移能力（P<0.05，M0376-2.529图4）。表明LINC00475在肾癌中具有促癌作用。
*M172-1.9620.022N分期1.5NC
N0
219-2.553N115
-1.540
0.050
*
si#10）941.0
si#2
D注：
*P<0.05具有统计学差异（OhtworOverallSurvival
G0.5
lleC100Lowexpression
0.0
800
1
2
3
4
5
Days
A
lavivr60ustnecr40Pe20Log⁃rankP=0.001
00
50
100
150
B
time（months）
*
1000*
图2Kaplan⁃Meier分析LINC00475表达水平与肾癌患
sl者预后的关系
le800Cdeta6002.3siRNA可有效下调LINC00475的表达griMfo为了避免脱靶效应，我们分别转染两条siRNA
400rebm（si#1、si#2）进入786⁃O中，发现与对照组（NC组）相uN200比，LINC00475的表达量明显下降。表明siRNA可0
以有效下调LINC00475的表达（P<0.05，图3）。NC
si#1
si#2
C2.4下调LINC00475抑制细胞的增殖能力及迁移
图4
LINC00475的表达对肾癌细胞786⁃O的影响
A.下
能力
调LINC00475抑制肾癌细胞786⁃O的增殖能力；B.下调利用MTS法，我们发现下调LINC00475可以LINC00475下调肾癌细胞786⁃O的迁移能力
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2.5GSEA分析LINC00475相关生物学通路参与的相关生物学通路。GSEA结果显示，在我们将TCGA数据库的肾癌RNAseq分为
LINC00475高表达组中，与cyclinD1、VEGFA、WNTLINC00475高表达组（n=20）及低表达组（n=20），相关的基因集发生显著上调（NOMP<0.01，FDR并对其进行GSEA分析，以此探讨肾癌中LINC00475
Q<0.05，图5）。
图5GSEA分析LINC00475相关生物学信号通路
3讨论
与癌旁正常组织相比，LINC00475在肾癌组织中显著高表达。并且在收集的手术切除的肾癌组织lncRNAs的身份从之前的“噪声”到如今的基以及癌旁正常组织中得到了验证。我们利用统计因调控因子的转变非常大，高通量技术的发展使学的方法，进一步分析TCGA数据库中的临床资越来越多的lncRNAs出现在科研人员的视野当料，发现LINC00475的表达与肾癌患者肿瘤分期、中。尽管这些新发现的lncRNAs的作用大部分仍远处转移呈正比。而且高表达LINC00475的肾癌然是未知的，但研究发现，lncRNAs能在分子层面患者总体生存时间明显低于低表达LINC00475的上调控基因表观遗传学上的表达，从而影响肿瘤肾癌患者。进一步在体外实验中，我们下调肾癌的发生、生长、侵袭、转移等，还可以作为肿瘤标记细胞786⁃O中LINC00475的表达量，发现肾癌细胞物以及成为分子靶向治疗的靶点［9］。
的增殖能力以及迁移能力明显下降。我们随后对由于肾癌的发生、发展在分子机制中涉及了TCGA肾癌数据进行GSEA分析，结果显示在肾癌多方面的综合因素，包括基因突变，基因组的不中，LINC00475的表达可能通过激活WNT信号通稳定性，表观遗传学改变等［1］。因此，肾癌相关路及cyclinD1、VEGFA等相关基因，增强细胞的增lncRNAs也在肿瘤进展的过程中扮演重要角色。殖能力及迁移能力，进而促进肾癌的进展。
lncRNAGAS5（GrowthArrest⁃SpecificTranscript5）综上所述，我们的研究表明LINC00475的表首次于1988年通过消减杂交技术从NIH3T3细胞达上调的肾癌患者预后更差，肾癌中高表达的中分离而得。GAS5作为一种抑癌基因，在肾癌细LINC00475能够促进肾癌细胞的增殖、迁移能力，胞中的高表达可以诱导肾癌细胞的凋亡，抑制其促进肾癌的进展。然而LINC00475在肾癌中参与增殖性、迁移性、侵袭性，遏止肿瘤细胞周期［10］。的分子机制仍不明确，虽然GSEA分析提供了一定HOTAIR（HOXtranscriptantisenseRNA）在肾癌中的研究方向，但仍需进一步的实验进行验证。
高表达［11］。HOTAIR可通过与甲基化酶复合体PRC2的相互作用，将PRC2复合物招募到HOXD参
考
文
献
基因簇，通过组蛋白甲基化下调靶基因的表达，从［1］MaherER.Genomicsandepigenomicsofrenalcellcarcinoma
而调控AKT、WNT等信号通路，促进肿瘤的发生、［J］.SeminCancerBiol，2013，23（1）：10-17.
发展［12］。
［2］GarciaJA，RiniBI.Recentprogressinthemanagementofad⁃
目前仍无LINC00475的相关研究。本研究通vancedrenalcellcarcinoma［J］.CACancerJClin，2007，57（2）：112-125.
过下载分析TCGA数据库中肾癌的RNAseq数据，
（下转171页）
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171
reverseshumanisletdysfunctionandapoptosistriggeredbybetes，2005，54（8）：2424-2429.
hyperglycemiaandLIGHT［J］.JMolEndocrinol，2018.［Epub［12］MarcondesMC，PolingM，WatryDD，etal.Invivoosteopon⁃
aheadofprint］
tin⁃inducedmacrophageaccumulationisdependentonCD44ex⁃［7］ShaoB，BayraktutanU.Hyperglycaemiapromoteshumanbrain
pression［J］.CellImmunol，2008，254（1）：56-62.
microvascularendothelialcellapoptosisviainductionofprotein［13］HiranoY，AzizM，YangWL，etal.Neutralizationofosteopon⁃
kinaseC⁃ssIandprooxidantenzymeNADPHoxidase［J］.Re⁃tinattenuatesneutrophilmigrationinsepsis⁃inducedacutelungdoxBiol，2014，2：694-701.
injury［J］.CritCare，2015，19：53.
［8］MatlagaBR，CoeFL，EvanAP，LingemanJE.Theroleof
［14］LeavenworthJW，VerbinnenB，WangQ，etal.Intracellular
Randall′splaquesinthepathogenesisofcalciumstones［J］.JosteopontinregulateshomeostasisandfunctionofnaturalkillerUrol，2007，177（1）：31-38.
cells［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2015，112（2）：494-499.
［9］KhaskhaliMH，ByerKJ，KhanSR.Theeffectofcalciumon
［15］LeavenworthJW，VerbinnenB，YinJ，etal.Ap85alpha⁃os⁃
calciumoxalatemonohydratecrystal⁃inducedrenalepithelialin⁃teopontinaxiscouplesthereceptorICOStosustainedBcl⁃6jury［J］.UrolRes，2009.37（1）：1-6.
expressionbyfollicularhelperandregulatoryTcells［J］.Nat［10］ThongboonkerdV，SemangoenT，SinchaikulS，ChenST.Pro⁃
Immunol，2015.16（1）：96-106.
teomicanalysisofcalciumoxalatemonohydratecrystal⁃induced［16］BehfarS，HassanshahiG，NazariA，KhorramdelazadH.A
cytotoxicityindistalrenaltubularcells［J］.JProteomeRes，brieflookattheroleofmonocytechemoattractantprotein⁃12008，7（11）：4689-700.
（CCL2）inthepathophysiologyofpsoriasis［J］.Cytokine，［11］JustoP，SanzAB，EgidoJ，OrtizA.3，4⁃Dideoxyglucosone⁃3⁃
2017.［Epubaheadofprint］
eneinducesapoptosisinrenaltubularepithelialcells［J］.Dia⁃
（收稿日期：2018-02-28）
（上接166页）
［3］SultmannH，DiederichsS.LongnoncodingRNA：“LNCs”to
（13）：2553-2557.
cancer［J］.EurUrol，2014，65（6）：1152-1153.
［9］EvansJR，FengFY，ChinnaiyanAM.Thebrightsideofdark
［4］PontingCP，OliverPL，ReikW.Evolutionandfunctionsof
matter：lncRNAsincancer［J］.JClinInvest，2016，126（8）：longnoncodingRNAs［J］.Cell，2009，136（4）：629-641.
2775-2782.
［5］Martens⁃UzunovaES，BottcherR，CroceCM，etal.Longnon⁃
［10］QiaoHP，GaoWS，HuoJX，etal.Longnon⁃codingRNA
codingRNAinprostate，bladder，andkidneycancer［J］.EurGAS5functionsasatumorsuppressorinrenalcellcarcinomaUrol，2014，65（6）：1140-1151.
［J］.AsianPacJCancerPrev，2013，14（2）：1077-1082.［6］GaoJ，AksoyBA，DogrusozU，SchultzN.Integrativeanalysis
［11］WuY，LiuJ，ZhengY，YangZS.Suppressedexpressionof
ofcomplexcancergenomicsandclinicalprofilesusingthecBio⁃longnon⁃codingRNAHOTAIRinhibitsproliferationandtumou⁃Portal［J］.SciSignal，2013，6（269）：pl1.
rigenicityofrenalcarcinomacells［J］.TumourBiol，2014，35［7］CeramiE，GaoJ，DogrusozU，etal.ThecBiocancergenom⁃
（12）：11887-11894.
icsportal：anopenplatformforexploringmultidimensional［12］XiaM，YaoL，ZhangQ，etal.LongnoncodingRNAHOTAIR
cancergenomicsdata［J］.CancerDiscov，2012，2（5）：401-promotesmetastasisofrenalcellcarcinomabyup⁃regulating404.
histoneH3K27demethylaseJMJD3［J］.Oncotarget，2017，8［8］冯春琼，邹亚光，周其赵，等.GSEA在全基因组表达谱芯
（12）：19795-19802.
片数据分析中的应用［J］.现代生物医学进展，2009，9
（收稿日期：2018-02-06）
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