(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105466873 A (43)申请公布日 2016.04.06
(21)申请号 201610008223.1(22)申请日 2016.01.05
(71)申请人石家庄新宇三阳实业有限公司
地址051430 河北省石家庄市栾城区太行大
街(72)发明人张拴力 扈士海 赵地顺 张桂彦
王素新(74)专利代理机构石家庄新世纪专利商标事务
所有限公司 13100
代理人侯迎新(51)Int.Cl.
G01N 21/31(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图3页
(54)发明名称
一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法(57)摘要
本发明公开了一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法采用分光光度法，具体方法为：选用一种指示菌，通过测定在含有一定浓度的乳酸链球菌素的培养基的发酵液中指示菌生长的OD值来制做标准曲线，然后发酵液直接接种，对比确定发酵液中乳酸链球菌素的浓度；所述指示菌选用藤黄微球菌。本发明通过设计对藤黄微球菌的培养基进行了系统优化，并在此基础上，建立一种可快速检测Nisin效价的改进的分光光度法，这样不仅节省了时间，提高了准确度，还降低了成本。本发明在检测中对培养基配方进行优化，在基础培养基基础上添加了一些营养成分，保证指示菌的生长，进而满足大量样品快速检测的要求。 C N 1 0 5 4 6 6 8 7 3 ACN 105466873 A
权 利 要 求 书
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1.一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法，其特征在于：采用分光光度法，具体方法为：
选用一种指示菌，通过测定在含有一定浓度的乳酸链球菌素的培养基中指示菌生长的OD值来制做标准曲线，然后测定含有一定量的待测发酵液的培养基中指示菌生长的OD值，对比确定发酵液中乳酸链球菌素的浓度；
所述指示菌选用藤黄微球菌；所述培养基中添加了葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O。
2.根据权利要求1所述的发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法，其特征在于：所述培养基中添加的下列组份的重量百分含量为：葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.03％。
3.根据权利要求2所述的发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法，其特征在于：所述培养基的各组份的重量百分含量为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、NaCI 0.5％、葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.03％。
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说 明 书
一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法
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技术领域
[0001]本发明涉及发酵液中乳酸链球菌素的检测，尤其是涉及一种快速批量化检测乳酸链球菌素效价方法的改进。
背景技术
[0002]乳链菌肽(乳酸链球菌素，简称Nisin)是从乳酸乳球菌的代谢产物中提取得到的一种多肽物质，由34个氨基酸组成，能显著抑制革兰氏阳性菌的增长，可用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鲜，是一种公认的安全无毒的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂，广泛应用于食品工业，目前已有60多个国家批注允许使用。
[0003]Nisin定量分析的最初测定的方法为1934年Cox GA等人建议采用的甲基蓝还原法，后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析法，包括试管稀释法(TubeDilution)、浊度分析法(Turbidity Assays)、琼脂扩散法(Agar Diffusion Test)、ATP生物发光测定法(ATP Bioluminometry)、绿色荧光蛋白测定法(GFPbioassay)、微量滴定法(Microtitration)、HPLC等。
[0004]Nisin定量的生物分析法中最普遍是琼脂扩散法(ADT)，尤其适用于那些高度不透明的、不能用浊度分析法分析的样品。Wolfand Gibbons(1996)改进了琼脂扩散法，提高了灵敏度、准确性。其原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果，为消除干扰因素的影响，常使用Nisin标准液和未知样液在同一平板扩散，并由他们的抑菌圈直径及标准效价换算出效价。由于Nisin的扩散性能差，故常在检测培养基做加入1％Tween以促进Nisin在琼脂中扩散。但是人们又普遍地认为它的影响因素太多，操作繁琐，而且准确性、重复性也不是很理想。
[0005]生物分析的重要性不可否认，但费时，受低特效性、低灵敏度和源于食品提取液和发酵液相互干扰等因素的制约，借助于免疫方法的迅速、直接和灵敏的技术，现已开发出定量检测Nisin的免疫技术。免疫学方法具有高灵敏性，但是却并不具有高特异性，而且现阶段抗体制备困难、成本高，这些都限制了它的应用，不过随着抗体工程的发展，生产实用、廉价的检测试剂盒也不失为一个好的发展方向。[0006]现有的检测方法很多，但是都有各自的优缺点。为了适应研究和生产的迫切需要，Nisin的快速检测方法研究很有必要。在过去，人们也应用了许多其它的新方法来检测Nisin的含量，如辐射线法、电导率测定法、自动化浊度法，基质辅助激光解吸/离子化质谱法、毛细管区带电泳法、血细胞计数法等HPLC法。因为需要专用的仪器和设备，没有被广泛接受。
[0007]我们选择一种指示菌，通过测定不同Nisin浓度下指示菌的生长情况，做出标准曲线，同时对发酵液也加入指示菌测定指示菌在发酵液中的生长情况，从而判定发酵液中Nisin的效价，该方法可以一次做多个样品，具有一定的优势。[0008]在使用分光光度法检测指示菌生长情况的过程中，发现按中国工业微生物菌种保藏管理中心的说明中给出的培养基对藤黄微球菌进行培养，30℃下需要1-2天，生长缓慢，
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导致实验周期长、实验结果准确度差。
发明内容
[0009]本发明要解决的技术问题是提供一种改进的发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法，其不仅要节省时间，提高准确度，还要降低成本。[0010]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法，其特征在于：采用分光光度法，具体方法为：[0011]选用一种指示菌，通过测定在含有一定浓度的乳酸链球菌素的培养基中指示菌生长的OD值来制做标准曲线，然后测定含有一定量的待测发酵液的培养基中指示菌生长的OD值，对比确定发酵液中乳酸链球菌素的浓度；[0012]所述指示菌选用藤黄微球菌；
[0013]对上述藤黄微球菌的培养基进行优化，优化的方法为：优化培养基添加了葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O。
[0014]优化培养基的最佳组合为添加葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.03％。[0015]采用上述技术方案所产生的有益效果在于：[0016]1、本发明通过设计对藤黄微球菌的培养基进行了系统优化，并在此基础上，建立一种可快速检测Nisin效价的改进的分光光度法，这样不仅节省了时间，提高了准确度，还降低了成本。本发明在检测中对培养基配方进行优化，在基础培养基基础上添加了一些营养成分，保证指示菌的生长，进而满足大量样品快速检测的要求。[0017]2、在本发明中，葡萄糖的添加量对藤黄微球菌的生长影响最为显著，其次为K+的添加量，Mg2+的影响相对较小。因此培养基添加成分的最佳组合为葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.03％。所以最后得出的优化培养基方案为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、NaCl0.5％、葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.03％。附图说明
[0018]图1是培养基优化前后藤黄微球菌生长曲线对比；[0019]图2是基础培养基测定的Nisin标准曲线；
[0020]图3是优化培养基测定的Nisin标准曲线(即效价示意图)。
具体实施方式
[0021]液体基础培养基的制备：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，以上溶于蒸馏水1.0L，调PH值7.0。
[0022]固体基础培养基的制备：上述液体基础培养基中加入15.0克琼脂。[0023]用接种环挑取-40℃保藏的指示菌接种至固体基础培养基，30℃培养24小时。然后挑取单菌落接种10ml液体基础培养基中，30℃，120r/min摇床中培养约7小时，获得菌悬液，培养基优化和效价测定的菌种均用此菌悬液。[0024]实施例一
[0025]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养，每隔半小时取样。藤黄微球菌菌液浓度采用比浊法测定，即在波长600nm
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条件下测定其吸光度值，以不加菌悬液的液体基础培养基作为参比。最后，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线。[0026]实施例二
[0027]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.1％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.01％，对液体基础培养基进行优化；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。藤黄微球菌菌液浓度采用比浊法测定，以不加菌悬液的本实施例所述的优化后的液体基础培养基作为参比，培养5小时后在波长600nm条件下测定其吸光度值为0.913。[0028]实施例三
[0029]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.1％、K2HPO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.02％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。藤黄微球菌菌液浓度采用比浊法测定，以不加菌悬液的实施例所述的优化后的液体基础培养基作为参比,培养5小时后在波长600nm条件下测定其吸光度值为0.960。[0030]实施例四
[0031]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.1％、K2HPO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.03％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法(即实施例2或3中的方法，下述实施例同)测定吸光度值为1.014。[0032]实施例五
[0033]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.3％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.02％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定吸光度值为0.857。[0034]实施例六
[0035]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.3％、K2HPO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.03％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定吸光度值为1.638。[0036]实施例七
[0037]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.3％、K2HPO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.01％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定吸光度值为1.184。[0038]实施例八
[0039]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.03％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定吸光度值为1.421。[0040]实施例九
[0041]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％、
接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定MgSO4·7H2O 0.01％；
吸光度值为1.574。[0042]实施例十
[0043]在装有50ml液体基础培养基的250ml锥形瓶中，加入葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.02％；接入500ul菌悬液，在30℃，120r/min摇床进行培养。按上述方法测定
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吸光度值为1.766。
[0044]各实施案例重点在于不同培养基的配方调整，实施一为基本配方。上述实施案例2-10通过正交分析得，最佳组合为加入葡萄糖0.5％、K2HPO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.03％。[0045]分光光度法测定Nisin效价[0046]分光光度法：以液体基础培养基做参比，取OD600约为1.5的菌悬液按体积比1％的接种量分别加入到基础培养基和优化后的培养基中，加入Nisin母液，使每个试管中的Nisin分别为0、10、20、30、40、50(单位：U/ml)，摇床培养，30℃，120r/min，6小时后测量每个样品中的OD值。分析数据，建立标准曲线，如图2、图3所示。
[0047]将利用乳酸链球菌发酵生产Nisin的发酵液样品高速离心，取上层清液，得到处理后的发酵液样品，并稀释到一定倍数。另取一支试管，加入优化后的培养基(该优化后的培养基中是上述按体积比1％的接种量加入了OD600约为1.5的菌悬液的)，并加入稀释后处理过的发酵液样品，摇床培养，30℃，120r/min，6小时后测量每个样品中的OD值，通过OD值结合上述标准曲线及稀释倍数得到发酵液中Nisin的效价。
[0048]藤黄微球菌在优化前后的培养基中的生长曲线如图1所示，可看出在基础培养基中藤黄微球菌生长速度缓慢，且5小时后达到最大OD值为1.726，之后进入衰亡期。培养基优化后藤黄微球菌对数生长期延长，生长速度显著加快，最大OD值可达2.439，从而明显缩短Nisin效价测定所用时间。
[0049]使用Nisin标准品配制不同浓度的Nisin标准液，利用基础培养基和优化后的培养基分别配制菌悬液，向菌悬液中加入不同浓度的Nisin标准液，5小时后测量OD值，建立标准曲线。如图2、3。
[0050]对于培养基优化前后，Nisin效价的标准偏差计算结果见表1、2。[0051]表1 基础培养基测定Nisin效价的标准偏差
[0052]
15U/mlOD值1.026OD值0.991OD值0.770平均值0.929标准值0.819相对标准偏差14.94％
[0053]表2 优化培养基测定Nisin效价的标准偏差
[0054]
45U/ml0.5620.5840.5370.5610.5344.19％
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由表1、表2可看出，培养基优化后测定Nisin效价的标准偏差较培养基优化前更加
理想，图2、3的对比显示培养基优化后在一定浓度范围内，曲线的线性比例关系更好，说明培养基优化后利用分光光度法测定Nisin效价有利于准确度和稳定性的提高。该检测方法是有效的。
[0057]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明创造。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明创造的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明创造将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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