RT-qPCR操作说明书

1. 以下的Protocol主要适用于(1)所使用的DNA1反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs±匀是Fermentas公司的；而在qPCF中，所使 用的Supermix是Bio-RAD公司的。 2. RT-qPCF中的注意事项：

(1) MgC2 的浓度 2~4mM

(2) 模板的浓度50ng~5pg之间；

(3)

引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在 0.1~1uM之间选择；

(4) 退火温度的选择，首次设置比实际小5C的，之后在1~2C

选择；

(5) 引物设计的时候Tm值最好在60C附近，正反向引物的Tm

的差值在1~2C之间；

(6) 抽提得到的RNA需要验证RNA勺纯度，最好验证一下RNA

的完整性；

(7)

在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%(主要是 模板的加入量会影响反应体系中的 MgC2浓度)；

( 8) 扩增曲线一定要做。 通常如果有条件也要做退火温度梯度，获得最佳的退火温度。 另外就是， 一块板子上， 尽可能尽量多的样本，而不是基因；

(9) 扩增效率在 90~110%的范围内是可以接受的；

( 10) 内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路

以

取3. 有关引物设计 (1)

扩增子长度小于 150bp；

(2) 引物Tm的理想值57~60C;

(3) 3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个； (4) GC含量介于20~80%理想值40~60% (5) 避免引物二聚体及自身二级结构； (6) 避免引物内的自身重复序列；

4. 在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线， 做标准曲线的方法，以反转录得到的 cDNA为模板，用qPCR的引 物做PCF得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为 基底，以 10 为倍数，稀释 7~8个梯度(稀释点越多，稀释倍数越 大，数据越精确)，做qPCR然后得到标准曲线。利用标准曲线可 以验证下列因素： ( 1 ) 扩增效率； 扩增效率 E=10(2) 标准品的梯度范围； (3) PCR抑制剂的存在于影响； (4) PCR仪验证灵敏度。

-1/ 斜率

-1

注：如果使用反转录的试剂盒， 那么从反转录开始则会有试剂盒 的使用说明书，之后的步骤都按照说明书来！

RNA 抽提

1. 收集0D直等于0.2的硫化叶菌（ACVY,清洗细胞！ 2. 加入1ml的TRIzol，使用移液枪打匀几次！ 3. 室温下，孵育 5min；

4. 加入200ul的氯仿（每ml的TRIzol ）。用手剧烈震荡15s，室温 孵育 2~3min；

5. <12,000g, 4C离心 15min; 6. 小心移取无色相到新的离心管中！

7. RNA沉淀：加入0.5ml的异丙醇（每1ml的TRIzol ）。室温下孵育 10min; 8. 洗：移去上清，加入1ml的75%勺乙醇（每1ml的TRIzol ）,轻轻 涡旋混匀，£500g, 4C离心5min;

9. 稍微的风干RNA（不用风干的太狠），使用50ul的RNA-free Water

溶解RNA用移液枪混匀几次，55~60C孵育10min,测得浓度， 部分溶解的RNA的 A260/A280值<1.6. 10.

-80 C保存或者是直接使用！

除去RNA中的DNA

1. DNAE处理

RNA 10 buffer DNase I RNA-free water

<50ug 3uL 1-5U（根据RNA的量和DNA勺实用说明） Up to 30uL 37 C条件下孵育60min

2. 加入1卩I的50mM的EDTA之后65C孵育10min,主要是用于除 去 DNA1.

3. 将用DNA酶处理之后的RNA做PCR验证，使用荧光定量的引物做 PCR主要是用于验证RNA中的DNA有没有除尽！

反转录

第一条cDNA勺合成: RNA-free Water Total RNA (DNasel treated) Reverse Primer

Up to 12.5uL 10n g-5ug 终浓度100pmol （可适量增大） 轻轻混匀，65C孵育5min,之后放置在冰上5min;

依照下列顺序加入下列物质: 5*RT buffer RNase in hibitor dNTP mix (10uM) Reverse Tran scriptase 4 0.5 2 1 轻轻混匀，并且简单离心，主要是让反应均匀;

42C孵育60min,之后70C反应10min

RT-qPCR反应

反应体系组成:

组成 Sso EvaGree n supermix Premier mix RNA-free Water DNA template Total volume 体积/每个反应（ul） 5 Variable 终浓度 1* 300~500nM（常用 500） Variable Variable （ <10%体 系） 10 Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR system

Cycli ng Step En zyme activati on Den aturati on Ann eali ng/exte ntio n Temperature 95 95 55~60 Time 30s 5s 20s Cycles 1 30~40