冰冻切片技术

冰冻切片技术

1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。

2：实验步骤：

①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上

②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。放至冰冻机中降温处理

③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。

④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。

⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。

⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃

⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦

无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。

⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。

⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序

⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）

①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作

②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观

3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。

4：结果分析及讨论：

① 切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。

② 切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片

③ 在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染

④ 严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察

5：思考题：

① 什么时候做冰冻切片：

1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤

2：判断肿瘤的良恶性

2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。

3：对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织

4：显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病理如脂肪瘤及肉瘤

② 冰冻切片的优缺点：

优点1:简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。

2：快速，用时短

3：组织变化不大

4：能很好保存脂类，类脂等成分。

缺点：

1：不容易做连续切片

2：切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响过大及染色效果

3：不容易制作较薄的切片

4：组织块在冻结过程中容易产生的冰晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。