(完整word版)实验一植物中总糖的测定

实验一植物中总糖的测定 ——3，5-二硝基水杨酸比色法

实验目的

（1）掌握总糖定量测定的基本原理

（2)熟悉3,5—二硝基水杨酸定糖法的基本操作 实验原理

各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖.利用溶解性质不同,可将植物样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来。再用水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3—氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质），还原糖则被氧化成糖醛酸及其他产物。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成比例关系，在0nm波长下测定棕红色物质的吸光度，通过标准曲线，便可求出样品中总糖的含量。多糖水解时,在单糖残基上加了一个分子水，因而在计算中需扣除已经加入的水量，测定所得的总糖量乘以0。9即为实际的总糖含量。 实验材料、仪器与试剂

1．实验材料

面粉 2．实验仪器

刻度试管或比色管，刻度吸管,恒温水浴锅，烧杯，容量瓶,电子天平，分光光度计，三角瓶。 3．试剂

（1)1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取500mg分析纯葡萄糖,置于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到500ml的容量瓶中.以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

(2）a：3，5—二硝基水杨酸试剂：取6.5g3，5—二硝基水杨酸溶于少量热蒸馏水中，溶后移入1000ml 容量瓶中,加入325ml 2mol/L氢氧化钠溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却，定

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容至1000ml。

b:3，5—二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L氢氧化钠溶

液加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，储于棕色瓶中备用。

（3）碘—碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。 (4）酚酞指示剂：称取0。1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。 （5）6mol/L盐酸溶液 （6)6mol/L氢氧化钠溶液 操作步骤

1．葡萄糖标准曲线制作

取7支20mL 具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀。在0nm波长下，以0号管为对照，分别测定其它六支管的吸光度，并绘制标准曲线。

表1 葡萄糖标准曲线制作

管号 0 1 2 3 4 5 6

1mg/ml葡萄糖标准液（ml)

0 0.2 0。4 0.6 0。8 1.0 1。2

蒸馏水 (ml） 2 1。8 1。6 1。4 1.2 1.0 0。8

DNS(ml) 1.5 1。5 1.5 1.5 1.5 1。5 1。5

葡萄糖含量 (mg）

0 0.2 0。4 0.6 0。8 1。0 1。2

吸光度 (OD0)

2．总糖的水解和提取

准确称取1。00g食用面粉，放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置于沸水中加热水解30min。取1-2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘—碘化钾溶液，检查水解是否完全。

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如已完全水解,则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1 滴酚酞指示剂,用6mol/L NaOH 中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容,混匀，作为总糖待测液。

表2 样品总糖测定

管号

总糖待蒸馏水

测液（ml） （ml） 1 1 1

1 1 1

DNS (ml) 1。5 1.5 1.5

光密度值 查曲线葡萄（OD0) 糖量（mg）

7 8 9

按表2加入试剂后,其余操作与制作标准曲线相同。以制作标准曲线时的0号管为对照，测定各管吸光度,取平均值。 结果与计算

在标准曲线上查出相应的总糖的浓度，按下式计算面粉中总糖的含量。

查曲线所得总糖含量（mg）总糖（%）提取液总量稀释倍数0.9测定时取用量100

样品质量（g）1000注意事项

（1）样品量和稀释倍数的确定，要考虑本方法的检测范围，待测液的含糖量要在标准曲线范围内.

(2）标准曲线的制作与样品的测定要在相同条件下进行，最好是同时进行显色和比色。 思考题

（1）本实验中引起误差的原因有哪些？

(2）为什么说总糖的测定通常是以还原糖的测定方法为基础的？