山西医药杂志２０１７年２月第４６卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏ１．４６，Ｎｏ．３ ・２６７・ 双酶切和无缝克隆方法构建 ＨＣＶ ＣＯＲＥ表达载体的比较 王敏敏 赵 婕 常亚磊 陈浩男 陈思思 宋 静 魏建宏 【摘 要】 目的 以ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎｌ为载体骨架，通过双酶切方法和无缝克隆方法构建ＨＣＶ ＣＯＲＥ 真核表达载体，比较２种不同载体构建方法的优缺点，以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方 法使用ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ两种限制性内切酶分别酶切ＰＬＶｘ－ＩＲＥ ＺｓＧｒｅｅｎ１和目的基因聚合酶链反应（ＰＣＲ） 片段，形成带有相同黏性末端的线性载体片段和ＰＣＲ片段，然后利用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，连接产物转化大肠埃 希菌ＤＨ５ ａ感受态细胞，转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法 利用同源重组的原理，通过重组酶将靶基因ＰＣＲ片段和经Ｘｈｏ Ｉ酶切的ＰＬＶｘ＿ＩＲＥＳ＿ｚｓＧｒｅｅｎｌ线性载体重组连 接，连接产物同样转化人感受态细胞中，转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。 结果跟双酶切载体构建方法比较，同源重组法步骤相对简单，可以更高效快速地构建载体，但是假阳性率略高。 结论 同源重组法可更高效地构建载体，但假阳性率高。 【关键词】遗传载体； 克隆，分子； 同源重组 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃ０ＲＥ－Ｇｒｅｅｎ ｖｅｃｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ— ｔｉｏｎ ＷａｎｇＭｉｎｍｉｎ ，Ｚｈａｏ Ｊｉｅ，Ｃｈａｎｇ Ｙａｌｅｉ，Ｃｈｅｎ Ｈａｏｎａｎ，Ｃｈｅｎ Ｓｉｓｉ，Ｓｏｎｇ Ｊｉｎｇ，Ｗｅｉ Ｊｉａｎｈｏｎｇ． Ｔｈｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｎｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｙａｎｇ ０３２２００，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ＨＣＶ Ｃ０ＲＥ ｖｅｃｔｏ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ ＥｃｏＲ １ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ”ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ”ｏｎ ｆｌ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｆｌ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｌｉｇａｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎｌ—ＣＯＲＥ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｉｄ ｏｆ Ｔ４ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅ ｌｉｇａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ ｃｏｒｎ— ｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｐｌａｔｅｄ ｏｎｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ．Ｉｎ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏ— ｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｘｈｏ Ｉ—ｃｌｅａｖｅｄ ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ－Ｚｓ— Ｇｒｅｅｎｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅｎ ａｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉ— ｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ，Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｓｉｍｐｌｅｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｔ ａｌｌｏｗｅｄ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｂｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｑｕｉｃｋｌｙ，ｂｕｔ ｉｔ ａｌｓｏ ｙｉｅｌｄｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｒａｔｅ ｏｆ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｑｕｅｓｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｃａｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｑｕｉｃｋｌｙ，ｂｕｔ ｉｔ ｈａｖｅ ａ ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ； Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ 分子克隆是基因重组和蛋白基因工程表达研究 中必不可少的手段之一，是分子生物学中的一种基 Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３—９９２６．２０１７．０３．００７ 基金项目：山西省大学生创新创业训练计划项目 （２０１４０５２） 本的操作方法［１ ］。而通过双酶切来构建载体是其 中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可 以识别并切割特定的核苷酸的原理，用２种不同的 限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有黏性末端 的靶基因片段，与同样经２种限制性内切酶切割得 到的带有相同黏性末端的线性载体在Ｔ４ ＤＮＡ连接 酶作用下进行连接，从而实现基因克隆［３ ］。但是在 实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不高等 问题，致使靶基因片段插入载体相当困难，为此人们 作者单位：０３２２００山西医科大学汾阳学院基础医学部 （王敏敏、赵婕、常亚磊、陈浩男、魏建宏），医学检验系（陈思 思、宋静） 通信作者：魏建宏，Ｅｍａｉｌ：１１７４９００３３２＠ｑｑ．ｅｏｍ 山西医药杂志２０１７年２月第４６卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏ１．４６，Ｎｏ．３ 采取了多种策略进行克隆。在使用经典克隆的同 时，人们开始追求更加高效的克隆方法，近些年发展 起来的无缝克隆方法，相比双酶切载体构建方法，该 方法的构建过程有些不同 ］。为比较双酶切方法 和同源重组方法各自的优缺点，现以ＨＣＶ ＣＯＲＥ真 核表达载体的构建为例报告如下。 １材料与方法 １．１材料 化的牛血清血蛋白（ＢＳＡ）０．５ Ｌ，载体１Ｏ Ｌ， ＢａｍＨ Ｉ １ Ｌ，ＥｃｏＲ Ｉ ２ Ｌ。总体系为５０ Ｌ。酶 切体系置３７℃反应１２ ｈ。在同源重组构建载体 的方法中，用ＸｈｏＩ限制性内切酶对ＰＬＶ－Ｇｒｅｅｎ载 体切割。酶切体系：双蒸水３３．５ Ｌ，１０ Ｘ ＢｕｆｆｅｒＤ ５ Ｌ，乙酰化的ＢＳＡ ０．５ Ｌ，载体１Ｏ Ｌ，Ｘｈｏ工１ Ｌ。总体系为５０ Ｌ。酶切体系置３７℃反应４ ｈ。 １．２．４ 目的片段与ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎｌ连接： 大肠杆菌ＤＨ５ａ购于索莱宝生物科技有限公 在双酶切载体构建方法中，利用ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—Ｚｓ— 司；质粒ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ＿ＺｓＧｒｅｅｎｌ，ｐＪＦＨ１（ＨＣＶ ２ａ 基因型ｅＤＮＡ）质粒为本实验室保存；限制性内切 酶ＢａｍＨ Ｉ，ＥｃｏＲ工，Ｘ ０ Ｉ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ购 自天根生化科技有限公司，Ｉｎ—Ｆｕｓｉｏｎ＠ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ购于Ｃｌｏｎｔｅｅｈ公司，凝胶回收试剂盒、质粒抽 提试剂盒购自Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ Ｔｅｋ公司，琼脂糖购于博 美生物科技有限公司。 １．２方法 １．２．１引物设计：双酶切构建方法中使用的引物 为ＣｏＲＥ正向引物：ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＧＣＡＣ— ＣＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＴＣ；反向引物为：ＣＧＧＧＡＴＣ— ＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡ．。Ｂａｒｎ Ｈ Ｉ的酶切位点是Ｇ ＧＡＴＣＣ，ＥｃｏＲ Ｉ的酶切位点是 Ｇ ＡＡＴＴＣ。同源重组方法使用的引物为ＣＯＲＥ 正向引物：ＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＡＴＧＡＧＣＡ— ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ；反向引物为：ＴＡＧＡＡＣＴ— ＡＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＣＧＧＴ。 该方法应用同源重组原理进行连接，在同源重组中 为了保证目的片段插入载体的方向，正、反向引物 的５ 端分别加入Ｘｈｏ Ｉ及该酶切位点前后约ｌ５个 碱基的载体序列。 １．２．２聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的基因：扩增 ＣＯＲＥ目的基因。反应体系：正向引物１ Ｌ，反向 引物１ Ｌ，ｐＪＦＨ１模板０．５ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ ＦＬ，ｄＮＴＰ混合液０．５ ＦＬ，缓冲液２．５ Ｌ，双 蒸水１９ ｌ上Ｌ。反应条件：９５℃３ ｍｉｎ预变性，９５℃ ３０ Ｓ，５５℃３０ Ｓ，７２℃１５０ Ｓ，共３４个循环。７２℃ ５ ｍｉｎ充分延伸。ＰＣＲ产物４℃保存，并进行１ 琼脂糖凝胶电泳鉴定和纯化。 １．２．３ ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｅｅｎ１载体酶切：在双酶 切构建载体的方法中，用ＢａｍＨ工和ＥｃｏＲ工限制 性内切酶对ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｅｅｎｌ载体进行切割。 酶切体系双蒸水３１．５ Ｌ，１０ＮＢｕｆｆｅｒＥ ５ Ｌ，乙酰 Ｇｒｅｅｎｌ及目的基因ＣＯＲＥ酶切后两端的黏性末 端，用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶把ＰｃＲ产物连接人ＰＬＶＸ— ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｅｅｎｌ。连接体系：２ Ｌ插入目的片段，１ Ｌ ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｅｅｎ１，１ Ｌ Ｌｉａｇｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ， ０．５ Ｌ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉａｇｓｅ，总体系为１０ Ｌ。在同源 重组方法中将ＰＣＲ产物重组人ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ＿Ｚｓ— Ｇｒｅｅｎｌ。重组反应体系：目的片段０．３２ Ｌ， ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｅｅｎｌ １．６４ Ｌ，酶２ Ｌ，双蒸水 ６．０３ Ｌ。总体系为１０ Ｌ。 连接产物转化人大肠埃希菌感受态细胞中，转 化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳 性克隆筛选并测序。 ２ 结 果 ２．１双酶切法载体构建 ２．１．１ 目的基因ＣＯＲＥ的扩增：以ｐＪＦＨ１为模 板，用设计引物扩增目的基因，１ 琼脂糖凝胶电泳 显示扩增产物约为６５１ ｂｐ，与预期结果一致（图 １） Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：目的基因ＣＯＲＥ 图１ ＣＯＲＥ基因ＰＣＲ产物电泳鉴定 ２．１．２ ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ—ｚｓＧｔｅｅｎ１载体双酶切：用 ＢａｍＨ工和ＥｃｏＲ工限制性内切酶对ＰＬＶＸ—ＩＲＥＳ— ＺｓＧｒｅｅｎｌ载体进行切割，结果见图２。 ２．１．３ ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１载体与目的片段连 接及鉴定：连接产物转化ＤＨＳａ感受态细胞，转化 菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板。进行琼 山西医药杂志２Ｏ１７年２月第４６卷第３期Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｈｒｕａｒｙ ２Ｏ１ ７，Ｖｏ１．４６，Ｎｏ．３ 【 ｊ ｊＩ Ｉ Ｍ：Ｉ）ＮＡ ｎⅢｒｋ（ ；ｌ：Ｉ－ Ｉ Ｖ（ ｒ ｎ载体 切；２：ＰＩ．Ｖ（ｍ、 Ｉ１载 ＾ Ｂ Ａ ：Ｍ：Ｉ）ＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＩ．Ｖ（ ｒ ｃ＿ｅｌｌ酶切图 体未酶切 Ｉ｛ ：Ｍ：Ｉ）ＮＡ ｎｌａｒｋ￣ｌｒ；１～４：纯化［【Ｊ】收的线 ｒ｝：Ｉ ＶＧｒｅｅｎ 图２ ＰＩ ＶＸ ＩＲＥＳ Ｚｓ（ｊ－’¨（ｍ１载体双酶切图 图５ Ｉ’Ｉ Ｖ（；ｒｅｅｎ载体单酶切及纯化回收产物鉴定（Ａ；ｌ｛） ＾Ｉ ｃ２ 脂糖电泳 定，结果 图３；歼送北京牛Ｔ进干ｆ洲序 鉴定，结果 示载体构建成功。 ’ １ Ｍ：ＤＮＡ ｌｌｌ￣ｌｒｋｃｒ；１：｝】１ Ｖ ｔ＂（’（）Ｒ｜ｃ舰｜ＪＪ ； ：１ １ Ｖ Ｇｔｅｅｎ一（、（）ＲＥ术脯切 图：｛ 阳性克隆Ｉ 【’Ｒ鉴定 ２．２无缝克隆法构建载体 ２．２．１ Ｉ】的基冈Ｃ（）ＲＥ的扩增：以１）ＪＦＨ１为模 板，扩增¨的基冈，１ 琼脂糖凝胶电泳显示扩增产 物约为６５１ １）Ｉ】，与预期结果・敛（｝冬１ ４）。 Ｍ：ＤＮＡ ｒＩ１ ｒｋｅｒ；ｌ：（ （】ＲＥ Ｐ（’Ｒ 物 图，１ 【、（）ＲＥ基因Ｉ 【’Ｒ产物鉴定 ２．２．２ ＰＩ ＶＸ—ＩＲＥＳ—ＺｓＧｒｃｃｎ１载体单酶切及纯 化：用Ｘｈｏ Ｊ限制 Ｈ－：内切酶酶１＝Ｊ＝Ｊ ＰＩ ＶＸ—ＩＲＥＳ—Ｚｓ— Ｇｒｅｅｎ１，酶切及纯化结果见 ５。 ２．２．３ ＰＩ ＶＸ—ＩＲＥＳ ＺｓＧｒｃｅｎ１载体与日的片‘段＿审 组连接及鉴定：重组连接产物转化ＤＨ５ ｃ￣感受念细 胞后涂布含氨苄青霉素的Ⅲ体培养基 板，川ｌ 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结ｌ粜见图６。测序 爪 载体构建成功。 ３ 讨 论 分子生物学经过２Ｏ多年的发展，利用限制性 内切酶和连接酶的方法成为载体构建中一个稳定 Ｍ：ｌｊＮＡ ＩＩ１．＿ｒｋｅ ；１～２：Ｐ１ Ｖ（ ｒ ㈤Ｌ （小Ｅ黼切鉴疋 图６ 阳性克隆ＰＣＲ鉴定 而有效的系统。住整个载体的构建过程中，可根据 实验要求选择合适的克隆方法，最大程度地利用每 种方法的优点。经典的双酶切构建载体方法比较繁 琐。首先，其蘩个过程涉及Ｉ＿】的基因扩增，载体和目 的基 酶切，感受态细胞转化和阳性克隆的筛选等， 每一个步骤都必须严格控制其反应条件 “ 。其次， 舣酶切的效率相对不高 ，冈为许多限制性内切酶 不能正确 割位于Ｉ）ＮＡ片段末端的识别位点，它们 在酶切化ｊ：ＤＮＡ片段与次末端的识别位点效率不 高。凶此，不能确保在连接前ＰＣＲ片段是完全被切 开的，而Ｈ 同的酶所对应的缓冲液不同，内切酶只 有在最适合的缓冲液体系的环境Ｆ其效率才能得到 最优化， 足双酶切体系势必使其中一个酶的活性 有所损火。这样必定会致使酶切产物的不纯。这样 就使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准， 进而影响连接效率。相反．若采用无缝克隆法构建 载体与舣酶切法构建载体方法不同。首先，设计引 物时正阳引物５ 端前面加的是ＸｈｏＩ酶切位点及该酶 切位点 ｆ）Ｉ ＶＸ ＩＲＥ￣ＺｓＧｒｅｅｎ１载体中对应前面的 ｌ ５个碱琏载体片段，反向引物５ 端前面加的是Ｘ ｏＩ 酶切位点及陔酶切位点在ＰＩ ＶＸ—ＩＲＥ ｚｓＧｒｅｅｎｌ载 体中对ｆ、 后面的１ ５个碱基载体片段，如此设ｉｔ－引物 是为了保证｝｛的片段插入载体时的方向正确。其 次，同源氨组所需的载体只需要单酶切，用ＸｈｏＩ酶切 ＰＩ ＶＸ ＩＲＥ￣ＺｓＧｒｅｅｎｌ，使得Ｉ Ｉ ＶＸ＿ＩＲＥ Ｚｓ（二ｒｅｅｎ１ 成为两端都带着Ｘｈｏｌ位点的线性载体。相比双酶切 割载体， 酶切可以保证酶切后的载体都是单一的 线性片段．使得后续的重组连接更准确ｌ１ 。两种方 山西医药杂志２０１７年２月第４６卷第３期Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏ１．４６，Ｎｏ．３ 法各有利弊，双酶切法构建过程相对比较繁琐，无缝 克隆法构建过程相对简单，可以省去很多的时间和 ［５］刘斌，羊小海，王柯敏．基于线性荧光探针对Ｔ４ＤＮＡ连接酶 的活性分析口］．高等学校化学学报，２０１０，３（３）：４６３—４６７． ［６］邝翡婷，袁定阳，李莉，等．一种载体构建的新方法：重组融合 ＰＣＲ法［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２０１２，３１（６）：６３４—６３９． 精力，但假阳性率略高。 参考文献 ［１］Ｔｅｎｎｏ Ｔ，Ｇｏｄａ Ｎ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｎｇｈｐｕｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃ— ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＮＭＲ ｓｔｕｄｙ ｓｕｉ— ［７］欧阳平，李玉，严红，等．一种载体构建的新方法：一步克隆法 口］．湖北大学学报（自然科学版），２００７，２９（２）：１７８—１８１． ［８］陆云华，马立新，蒋思婧．一种通用高效的复杂载体构建的新 方法［Ｊ］．遗传，２００６，２８（２８）：２１２—２１８． ［９］韩凯，翁建峰，郝转芳．一种快速高效构建植物表达载体的方 法［Ｊ］．玉米学，２０１２，２０（１）：６１—６６． ［１０］Ｌｉｕ ＸＬ，Ｘｉａｏ Ｂ，Ｙｕ ＺＣ．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｓｐ９０ ｃｏｕｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｅｄ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏ￣ｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２００４，１７（４）： ３０５—３１４． ［２］Ｏｈｓｕｇｉ Ｔ，Ｋｕｍａｓａｋａ Ｔ，Ｕｒａｎｏ Ｔ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｇｅｎｏｍｅ ｆｒｏｍ ＭＴ－２ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎ— ｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，３２９（２）：２８１—２８８． ［３］王福利，赵爱志，韩月恒．Ｔ４ＤＮＡ连接酶对电转化率的影响 ［Ｊ］．中国现代医学杂志，２０１１，２１（１７）：１９７４—１９７６． ［４３ Ｗａｎｇ Ｓ，Ｚｅｎｇ Ｘ，Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＰＤＣＤ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｉｒｕｓ ｖｅｃｔｖｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１９９９，５（３）：１９９—２０８． ［ｎ］马凯，胡红霞，于婧．双酶切和同源重组方法构建ＰＭＩＲ－ｒｅ— ｐｏｒｔｅｒ载体的比较［Ｊ］．中国病原生物学杂志，２０１５，１０（６）： ４９５—４９９． （收稿日期：２０１６－１１—２１） ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２０１２，２８（１）：９１—９８． 讣 生 口 编委王友桂逝世 《山西医药杂志》编委王友桂教授，因病医治无效，于２Ｏ１７年２月１０日３时１８分逝世，享年８５岁。 王友桂同志，男，生于１９３３年１０月，河北省涿州市人，１９５８年毕业于北京医科大学医疗系，１９６３年工 作于山西医科大学第二医院。１９８５年心肾内科成立，担任了科主任。１９８６年５月加入中国共产党。１９９２ 年荣膺“全国卫生系统模范工作者”称号。 数十年来，王友桂教授长期从事心血管内科临床、教学和科研工作，是山西省心血管内科专业学科带头 人之一。他对冠心病的诊断，急性心肌梗死、心肌病的治疗，各种心律失常和心力衰竭等进行了一系列临床 研究，摸索出一系列新的诊断方法，在心血管专业这片广袤的天地里付出了滴水穿石的耐力，用辛勤的汗水 浇灌出了丰硕的成果。他率先开展了冠状动态造影和心内膜心肌活检，填补了省内空白；他结合临床实践， 积极总结探索，发表论文４Ｏ余篇，其中《心肌病３１例分析》《心肌病的心电图表现》在国内首次报道了较大数 量的病例，被引用于“内科讲座”一书中，有的文章还被介绍到了国外；他主编或参与编写出版了５部专著，其 中《心血管疾病分册》《卫技人员职称晋升题解》获省医药科技优秀著作二等奖；他还参审了多篇高质量的论 文、译文；他不仅为培养高层次的心血管专业人才呕心沥血，还通过系统的心血管病和心电图专题讲座，为厂 矿、企业、农村培训了千余名医疗技术骨干。 他多次被评为先进工作者、优秀教师、优秀党员干部；曾担任过中华心血管病学会委员，中国心功能学会 委员，山西省医学会心血管病专业委员会主任委员，山西省医药科技委员会内科专业委员会主任委员；１９８７ 年４月至１９９２年３月，他还担任过太原市第七届政协常委；１９９２年经国务院批准享受政府特殊津贴。 王友桂同志一生勤奋敬业，他热爱党的医疗事业，数十年如一日扎根临床，作为一名医务工作者，他淡泊 名利，视患者如亲人，为医疗、教学、科研事业奉献了毕生精力；作为老专家、老前辈，他为人师表，严谨治学， 培养了一批又一批的优秀人才；他德高望重、医术精湛，不失为大家风范，深受广大患者和医护师生的爱戴。 王友桂同志的一生，是勤奋敬业的一生，是光明磊落的一生。他的去世，使我们失去了一位优秀党员、一 位好战友。我们永远怀念他。 王友桂同志永垂不朽！ 《山西医药杂志》编辑部 ２０１７年２月１０日