最新siRNA研究进展

siRNA研究进展

siRNA( small interferance RNA, siRNA) 即小干扰性RNA，可作为RNA 干扰（RNA interference, RNAi）的引发物，能引起与siRNA 同源的mRNA 降解，进而抑制相应基因表达，在基因表达中起到十分重要的作用。

RNA 干扰是1998 年由美国科学家Andrew Fire在研究dsRNA(由反义RNA 和正义RNA形成的双链RNA )对线虫基因表达的影响时提出的[1]。他们发现dsRNA对基因表达抑制的程度比单独注入反义RNA 或正义RNA 都强得多，于是将这种由dsRNA 所引起的基因表达被抑制的现象称做RNA 干扰, 简称RNAi 。随着研究的逐步深入，科学家在不同生物物种中相继发现了RNA 干扰现象，这表明RNA 干扰这种基因的方式在生物界是广泛存在的，Andrew Fire等也因其在该领域的卓越贡献而获得2006年的诺贝尔生理与医学奖。RNA干扰技术在基因功能研究、抗病毒、抗肿瘤、药物靶点筛选和细胞信号传导通路分析显示了良好的应用前景，已成为分子生物学研究的重要技术手段之一。

一、RNA 干扰的作用过程及其特点 1、RNA 干扰的作用过程

(1) 起始阶段：在细胞内，双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21 个～23 个碱基的小RNA ，即小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 。siRNA 是由19个～21 个碱基配对形成的双链，并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。siRNA 是RNAi作用发生的重要中间分子，序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2 个～3 个突出的非配对的3′碱基;两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA 和其他双链RNA 的结构基础。平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA不具有RNAi 的功能[2]。

(2) 引发阶段：siRNA 与Argonaute 蛋白家族等结合，形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex, siRNP)。siRNP 在ATP 及其他未知因素参与下，使双链siRNA 解旋形成RNA 诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex, RISC) 。RISC 可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在，继而RISC 在dsRNA 的介导作用下与互补mRNA 结合，并将其降解。mRNA 被降解在转录后水平，抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( post transcriptional gene silencing, PTGS)。

(3) 循环放大阶段：在siRNA 诱导的RNAi 过程中，可能还存在siRNA 的循环放大过程，以维持它的RNA 诱导功能。此过程推测是以siRNA 为引物，互补mRNA 为模板，在RNA 依赖性RNA 合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase ,RdRP) 的作用下，合成新的双链RNA ，再由Dicer 作用，产生新的siRNA，完成siRNA 的放大过程，开始新的RNAi 循环[2, 3]。

图1 RNA 干扰的作用过程

2、RNA干扰的特点

RNA干扰的作用过程有如下特点：(1)稳定、持久：具有3＇端突出TT碱基的dsRNA尤为稳

定，不必像反义核酸那样需要化学修饰。(2)高度特异性：其一是只针对靶基因编码区的dsRNA才能产生RNAi；其二是序列中即使只有一个碱基改变都不会产生基因封闭作用。(3)高效性：这种高效性是针对反义RNA而言的，RNAi抑制靶基因的特异性和效率比反义RNA高10倍以上。(4)ATP依赖性：RNAi是一个ATP依赖的过程，可能与Dicer和RISC的酶切反应必须有ATP提供能量、ATP能维持dsRNA的5＇端磷酸化有关。(5)传递性：RNAi效应可在生物体内的不同细胞之间传递。(6)合成简便：研究者只需提供相应靶位点，就可以通过化学合成、体或病毒载体体内转录等方法合成siRNA，合成周期短，且不需要化学修饰即可稳定表达。(7)浓度依赖性：dsRNA效应的RNAi强度随着其浓度的增高而增高。(8)模板选择性：RNAi只有效作用于该基因的外显子，对内含子无影响[3]。

二、siRNA的制备及其修饰 1、siRNA的制备

siRNA的制备主要有以下几种方法：（1）体外化学合成siRNA：该方法合成成本较高，转入宿主细胞效率、在宿主细胞中的稳定性以及RNAi作用效率均不确定。（2）体外转录合成siRNA：该方法是采用T7RNA聚合酶，以先合成DNA链为模板反转录合成dsRNA，与化学合成法相比，该法是一种较为经济的方法，适用于筛选有效的siRNA，不适用于大量的siRNA合成。（3）长片段dsRNAs经RNase III降解得到siRNA：该方法省时、省力，但有可能引发非特异基因沉默。（4）siRNA表达载体细胞内表达siRNA：该方法是通过转染含有RNA聚合酶III启动子U6或H1的dsRNA表达载体到细胞内，通过其在细胞内的表达产生siRNA，RNAi表达载体体内转录方法有二种，一种方法是将目的编码序列的正义链和反义链分别克隆到上述载体的转录启动子下，转染细胞后，根据其碱基互补原则在体内构建siRNA双链；另一种方法是体外合成目的编码序列的反向重复序列，中间以4～9nt的碱基隔开，形成发夹结构，将具有以上结构的载体转入细胞后，载体就能表达出短发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA),这种RNA在细胞中加工成为21～23个碱基大小的类似siRNA的分子，启动RNAi过程，引起基因沉默。（5）PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达：该方法方便、快捷，是筛选siRNA最有效的方法，但很难转染到细胞中[4]。

2、siRNA的修饰

由于siRNA的稳定性差易被核酸酶降解，且胞膜通透性差难以被吸收，因此，通过siRNA的修饰提高siRNA的稳定性和通透性，并增强其与靶序列的特异性亲和力就变得十分有必要。目前常用的修饰方法有以下几种：（1）在磷酸-核糖骨架上进行修饰，可运用了硫代、肽核酸、吗啡啉、乙氧基硫代磷酸三酯、甲基膦酸酯等方式。（2）在RNA 核糖上进行修饰，主要有2＇-位的羟基被甲基、烯丙基、氨基、氢、氟、或甲氧基取代等方法。（3）在RNA的3＇-端连接一个反转的3＇-核苷酸，以提高RNA的稳定性[5]。

图2 siRNA修饰的常用方式

三、siRNA的应用

基于siRNA的RNAi技术作为新的基因阻断技术已广泛应用于基因组功能研究，抗病毒治疗，肿瘤治疗以及基因治疗等诸多领域，将在今后的疾病治疗方面发挥越来越独特的优势[6]。

在基因组功能研究方面，RNAi 能够在多种生物中被用来灭活特异序列的基因，产生类似基因

被“剔除”的效应。它与传统的基因剔除技术相比具有投入少、周期短、操作简单等优势。在针对特定基因的研究中，首先利用此技术剔除待研究的目标基因，然后通过细胞表型改变的观察、免疫蛋白印迹、免疫荧光等方法即可对基因的表达及功能进行分析。Harborth 等利用RNAi 技术对21 个在亚细胞水平定位和功能不同的基因进行了研究，并根据特异性基因沉默后细胞生长情况，将所研究的基因分为细胞必须基因和细胞非必须基因。迄今为止，RNAi 技术在真菌、植物、线虫、果蝇及哺乳动物的基因功能研究中发挥了显著作用[7]。

在肿瘤治疗方面，由于RNAi 能够在哺乳动物系统中被用来灭活特异序列的基因片段，许多学者便考虑凭借此技术在基因水平上对肿瘤进行治疗。肿瘤是多基因、多因素疾病, 是多个基因相互作用的基因网络的结果。利用siRNA 特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达, 使这些基因保持在静寂或休眠状态, 从而达到抗肿瘤作用, 故siRNA 很可能成为能够特异作用于肿瘤的理想抗癌药物。在多种癌症都已证实RNAi 技术可抑制肿瘤细胞的体外和活体内生长。Elbashir 等成功将Hela 细胞中编码核有丝蛋白以及编码核纤蛋白的基因同时敲除，成功抑制了肿瘤细胞的生长[8]。Aloy 等通过RNAi 减少热休克蛋白27 的表达, 能显著提高鼻咽癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤对放疗的敏感性。RNAi为肿瘤的基因治疗提供了一条新的思路和研究方法[9]。

目前RNA干扰在生物化学、分子生物学、制药、医学等各个领域得到了广泛的应用，随着该技术的成熟，越来越多的生物学难题有望借助RNA干扰技术获得破解，更多的疾病也可能借此技术而取得突破。

参考文献

1 Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C., Nature 1998,

391, 806-811.

2 Manoharan, M., Curr Opin Chem Biol 2004, 8, 570-579.

3 Karagiannis, T. C.; El-Osta, A., Cancer Biol Ther 2004, 3, 1069-1074.

4 Takabatake, Y.; Isaka, Y.; Mizui, M.; Kawachi, H.; Takahara, S.; Imai, E., Biochem Biophys Res Commun 2007, 363, 432-437.

5 Zhang, H. Y.; Du, Q.; Wahlestedt, C.; Liang, Z., Curr Top Med Chem 2006, 6, 3-900.

6 Ying, S. Y.; Chang, C. P.; Lin, S. L., Methods Mol Biol 2010, 629, 205-237.

7 Harborth, J.; Elbashir, S. M.; Bechert, K.; Tuschl, T.; Weber, K., J Cell Sci 2001, 114, 4557-4565.

8 Elbashir, S. M.; Harborth, J.; Weber, K.; Tuschl, T., Methods 2002, 26, 199-213.

9 Aloy, M. T.; Hadchity, E.; Bionda, C.; Diaz-Latoud, C.; Claude, L.; Rousson, R.; Arrigo, A. P.; Rodriguez-Lafrasse, C., Int J Radiat Oncol Biol Phys 2008, 70, 3-553.