精子活力测定

密度检查

一、实验目的

掌握检查精子密度、活率的方法；熟悉感观检查精液品质的方法。

二、实验材料

1. 精液 选用牛、羊、猪、马、犬、兔任意一种动物的新鲜精液。

2. 药械用品 显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温台）、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、温度计、滴管、擦镜纸、纱布、蒸馏水、3%和0.9%氯化钠溶液、2%煤酚皂溶液、1/3000新洁尔灭溶液、75%酒精。

3. 其他 精子密度挂图及有关图表。

三、实验内容

（一）精液的感观检查

观察测定下列各项结果并记入登记表内。

1. 测定射精量 将采得的精液倒入有刻度的试管或集精杯中，测量其容量。各家畜的射精量平均为：马70（30—100）ml，驴50（10—80）ml，牛4（2—10）ml，羊1.0（0.7—2.0）ml，猪250（150—500）ml。

2. 色泽、气味观察 观察精液的色泽并嗅闻气味。

3. 云雾状的观察 观察牛、羊精液翻腾滚动的云雾状态，并按以下符号记入表内，云雾状显著者以“+++”表示，有云雾状者以“++”表示，云雾状不明显或无云雾状者以“+”表示。

（二）精子密度检查及活率评分

1. 精子的密度 取1小滴精液在清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，不得存留气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置于显微镜下放大400—600倍观察，按下列等级评定其密度。

密——在整个视野中精子密度很大，彼此之间空隙很小，看不清楚各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升精液含精子数约在10亿个以上，登记时记以“密”字。

中——精子之间的空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度，有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2—10亿个之间，登记时记以“中”字。

稀——精子分散于视野内，精子之间的空隙超过一个精子的长度，这种精液每毫升所含精子是在2亿以下，登记时记以“稀”字。

牛精子密度示意图 A:密；B.中；C.稀

2. 精子的活率评定 必须于采精后立刻在22—26℃的实验室内进行，最好是在37℃保温箱内进行，在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。

用玻璃棒蘸取1滴原精液或经稀释的精液（马、猪精液的精子密度低，可以不稀释，而牛、羊精液的精子密度大，须用0.9%氯化钠溶液或其他稀释液进行稀释，其温度须与精液温度相近），滴在载玻片上，加上盖玻片，其间应充满精液，不使气泡存在，也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，置于显微镜下放大250—400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中进行观察。

悬滴法检查精子活率精子的活动有3种类型，即直线前进运动、旋转运动和振摆运动。评价精

子的活率是根据直线前进运动精子数的多少而定的，即：

呈直线前进运动精子数精子活率100%

总精子数目前评定精子活率等级的方法有两种：

十级制——在显微镜视野中估测直线前运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级；90%者评定为0.9级；无直线前进运动精子的精液为“0”级。

牛、羊的精液中由于副性腺分泌物少，精子密度大，因此，要求精液达到”密0.6”（即密度为“密”，活率为“0.6”级）及“中0.8”级以上才能作为合格的精液。而马、猪的精

液中副性腺分泌物多，精子密度小，因此正常的精液定为“中0.6”、“稀0.8”以上的等级。

表1 种公畜精液品质检查登记表

畜别 畜号 采精时间 （年月日） 射精量 （ml） 色泽 气味 云雾状 密度 活率

实验四 精子数量计算和畸形率的测定

一、实验目的

1. 掌握测定每毫升精液中所含精子数的方法，以及测定精子畸形率的操作要点。 2. 测定每一头份冷冻精液内有效精子数，以确定是否符合输精要求。

二、实验材料

1. 精液 任一种公畜或雄性动物的新鲜精液或冷冻精液。

2. 器械 显微镜、载玻片、盖玻片、红细胞及白细胞稀释管、血（色素）吸管、血细胞计数盘、光电比色计、5ml试管、1ml及2ml吸管、玻棒、染色缸、染色架、玻片镊、纱布。

3. 几种染色液配方

（1）0.5%龙胆紫 0.5g 96%酒精 100ml （2）酒精固定液

40%甲醛（） 12.5ml 96%酒精 87.5ml （3）凡那他氏镀银染色液 ① 胡氏固定液

2ml 醋酸 1ml 蒸馏水 100ml ② 染色液

单宁酸 5g 石炭酸 1g 蒸馏水 100ml ③ 银溶液

银 0.25g 蒸馏水 100ml （4）威廉斯染色液

① 品红原液

品红 10g 96%酒精 100ml

② 伊红原液 将伊红溶于酒精中制成饱和溶液。 ③ 染色液

品红原液 10ml 5%石炭酸 100ml 取混合液 50ml 伊红原液 25ml

注：充分混合，至少放置14天后，经过滤可用于精子染色。 ④ 美蓝原液

美蓝 10g 酒精（96%） 100ml 4. 畸形精子形态图、血细胞计算盘构造图

三、实验内容

（一）精子数量测定

1. 血细胞计算盘测定法

（1）清洗器械 先将血细胞计算盘及盖玻片用蒸馏水冲洗，使其自然干燥。血吸管或红细胞和白细胞稀释管先用蒸馏水冲洗，再用95%酒精清洗，最后用乙醚清洗。试管及吸管洗净后须经烘干。

（2）精液的稀释

① 用1ml吸管准确吸取3% NaCl 0.2ml或2ml，注入小试管中。根据稀释倍数的要求，再用血吸管吸出10μl或20μl NaCl溶液弃去。

② 用血吸管或红、白细胞稀释管吸取精液至刻度10μl或20μl处。 ③ 用纱布擦去吸管尖端附着的精液，将精液注入到小试管中。 ④ 用拇指按住小试管口，振荡2—3min使其混合均匀。 （3）精子的计数

① 将擦洗干净的计算盘置于显微镜载物台上，在计算室上盖上盖玻片。

② 将试管中稀释好的精液，滴一滴于计算室上盖玻片的边缘，使精液自动渗入计算室。注意不要使精液溢出于盖玻片之上，也不可因精液不足而致计算室内有气泡或干燥之处，如果出现有上述现象应重新操作。

③ 静置3min后以400—600倍显微镜检查。

④ 统计出计算室的四角及共5个中方格即80小方格的精子数。

⑤ 统计每个小方格内的精子，只数小方格内压在左线和上线的精子。

⑥ 由5个中方格（80个小方格）所统计的精子数（X）代入下列公式即得出每毫升的精子数。

X40010稀释倍数1000每毫升精液所含精子数X50000稀释倍数 80

血细胞计数板及计算顺序和方法

确定精液稀释倍数可以按表1、2计算。

表1 精液稀释倍数 精液种类 稀释管种类 红细胞吸管 牛 羊 血吸管 白细胞吸管 猪 马 血吸管

表2 精子浓度计算 稀释倍数 200 100 为了减少误差，必须进行两次精子计数，如果前后两次误差大于10%，则应用第三次检查。最后在3次检查中取两次误差不超过10%的，求其平均数，即为所确定的精子数。

2. 光电比色计测定法 常用的光电比色计有581—G型、72—1型和76—1型等。 制备测定管，进行被检样品的比色。 （1）牛精液精子浓度的测定

① 用2.9%等渗柠檬酸钠液5ml，定点到100；取鲜精0.1ml加进入另一个装有4.9ml的2.9%柠檬酸钠的比色皿中。

如用581—G型比色计，要用42号蓝色滤光片比色；如用72—1型比色计，要用440nm进行比色，记录其透光度和光密度值（X值）。

② 同上另在测定管内加1滴8 mol的苛性钠，同除去精清的密度记录其透光度的光密

应乘常数 1000万 500万 稀释倍数 20 10 应乘常数 100万 50万 吸取时所达到的刻度 精液 0.5 1 10μl 20μl 0.5 1 10μl 20μl 3% NaCl 101 101 1990μl 1980μl 11 11 190μl 180μl 稀释倍数 200 200 200 100 20 10 20 10 度。

（2）用血细胞计数盘计数，待测各鲜精样品数批，每份样品测两次，如两次误差超过5%时需要重测。将两次平均值作为该透光度（或光密度）溶液的密度。用牛精液测定的结果见表3。

（二）直线前进运动精子数的计算（精子活率的计算）

方法基本和精子数量计算法相同，有以下几点不同。 1. 用0.9%生理盐水作为稀释液，以保持活精子的正常动动。 2. 显微镜应置于保温箱内，保持37—38℃。

3. 统计出4个角的4个及1个共5个方格中的非直线运动（包括死精子、摆动、旋转运动）的精子数，求出每毫升精液中非直线运动的精子数。

4. 将计算盘放入120℃的干燥箱中5min，利用高温杀死全部精子后，计数4角及5个方格的精子数，求出每毫升精液中的总精子数。

5. 计算直线前进运动精子的百分率，即精子活率：

精子活率总精子数非直线运动的精子数100%

总精子数表3 奶牛、肉牛精子密度查数表

透光度 亿/ml 24.71 24.4981 24.2333 23.9679 23.7025 23.4371 23.1717 23.9063 22.09 22.3755 22.1101 21.8447 21.7593 21.3139 21.0485 20.7831 20.5277 20.2523 19.9869 透光度 亿/ml 19.7251 19.4561 19.0907 18.9253 18.6599 18.3945 18.1291 17.8637 17.5983 17.3329 17.0675 16.6021 16.5367 16.2713 16.0059 15.7409 15.4751 15.2097 14.9443 透光度 亿/ml 14.67 14.4135 14.1481 13.8827 13.6173 13.3519 13.0865 12.8211 12.5557 12.2903 12.0249 11.7595 11.4941 11.2287 10.9633 10.6979 10.4325 10.1671 9.9017 透光度 亿/ml 9.6363 9.3709 9.1055 8.8401 8.77 8.3093 8.0439 7.7785 7.5131 7.2477 6.9823 6.7169 6.4515 6.1861 5.9207 5.6553 5.30 5.1745 4.8591 透光度 亿/ml 4.5937 4.3283 4.0629 3.7975 3.5321 3.2667 3.0013 2.7359 2.4705 2.2051 1.9397 1.6743 1.40 1.1435 0.8781 0.6127 0.3437 0.0819 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 59 60 61 62 63 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 90 91 92 93 94 95 96 97 98 （注：新鲜精液0.1ml+2.9% 柠檬酸钠4.9ml）

（三）每头份冷冻精液中有效精子数的测定

1. 随机取一份精液，用常规方法解冻后，较准确地评定出精子活率。

2. 在同一批冷冻精液中，再随机取一份精液（取一粒颗粒冷冻精液直接投入小试管中，不需加解冻液）。在60—80℃热水中经数分钟杀死全部精子，用1ml吸管准确量取被检精液，将测量过的精液依然注入到原试管内。

3. 另取一支1ml吸管，准确吸取2.9%柠檬酸钠溶液，取用量为1ml精液/头份，注入到精液试管中，充分混合均匀。这样试管内经稀释后的精液量即为1ml。

4. 取稀释后的精液，滴入血细胞计算盘内，计数5个方格中的精子数（设为X个）。 5. 按下列公式计算 （1）精子数/mlX400101000 80或者以X个精子数直接乘以5万即为1ml稀释后精液内的精子数。 （2）精子数/头份=精子数/ml×精液量（ml）/头份 （3）有效精子数/头份=精子数/头份×精子活率

（四）测定精子畸形率

1. 以细玻璃棒蘸取精液1滴，滴于载玻片一端，如系牛、羊精液应再加1—2滴0.9% NaCl溶液。

2. 以另一载玻片的顶端呈35度角，抵于精液滴上，向另一端拉去，将精液均匀涂抹于载玻片上。

3. 抹片于空气中自然干燥。

精液抹片的制备

1.将1滴精液滴在；2.玻璃片上用另一玻片

拉向液滴，使玻璃片边缘附着精液；3.将玻片推向另一端

4. 用下列任意一种方法固定染色。

（1）用0.5%龙胆紫酒精溶液染色3min，水洗、待干即可镜检，也可用蓝墨水染色。 （2）置于酒精固定液中固定5—6min，取出以水冲洗后，阴干或烘干，用蓝墨水染色3—5min，再用水冲洗，使之干燥后于显微镜下检查。

（3）凡那他氏镀银法 将自然干燥的抹片，以胡氏溶液滴在玻片上固定1min，水洗

10s，将染色剂滴在玻片上，慢慢加热至发生蒸气为止，用水洗30s后，再加上0.25%银2—3滴，立即滴上1滴氨水，抹片左右摇动，则产生混浊的黄褐色，再放在酒精灯上慢慢加热，经20s，直至发出水蒸汽的“白雾”状为止，最后再进行水洗，待干后便可镜检。

（4）威廉斯染法 将自然干燥的抹片放入无水酒精中固定4min，然后移入0.5%氯胺T（Chloramine-T）中浸2min左右，直到抹片上的粘液物质被除掉而变得清洁为止。再分别浸入蒸馏水和96%酒精中轻洗几分钟，投入石炭酸品红—伊红染液中停留10min，取出后在清水中蘸2次，最后移入美蓝溶液中停留5min，取出干燥后即可在显微镜下进行检查。

5. 镜检 将制好的抹片置于显微镜下，查数不同视野的500个精子，计算出其中所含的畸形精子数，求出畸形精子百分率。

１ ２ 1 A. 正常精子 B. 游离原生质滴 C. 各种畸形精子D. 精子头部脱落 E. 精子附有原生质滴 F. 精子附有

远侧原生质滴 G. 精子尾部扭曲 H. 精子顶体脱落 I. 各种家畜的正常精子 a猪 b. 绵羊c. 水牛 d. 牛 e. 马 2 A. 正常顶体 B. 顶体膨胀 C. 顶体部分脱落 D. 顶体全部脱落