精子活率

1、掌握精液的活力评定方法及评价指标；

2、掌握用血球计数板进行精子密度计数的方法；

3、了解并验证某些外界因素对家畜精于的影响，以加深和提高正确进行精液处理操作的科学意识，为学习人工授精技术奠定基础。 二、实验材料

1.精液样品：牛精液(冻精)或猪精液

2.药械用品：0．5、3％和0．9%氯化钠溶液，4％柠檬酸钠液、6％葡萄糖液(pH值3．0，7．0、8．0)、3％碳酸氢钠液、3％柠檬酸液、75％酒精，0．1％新洁尔灭液、2％来苏儿溶液，兔血清。温度计、镊子、漏斗、玻璃棒，大塘瓷盘、热水、显微镜、载玻片、盖玻片、乙醚、纱布、试管，2％煤酚皂液、保温箱、冰、普通显微镜、血球计数器、95％酒精、乙醚、保温瓶、脱脂棉、滴管、pH试纸、蒸馏水。 三、实验内容

(一)精子活率评定：

必须于采精后立刻在18—25℃实验室中进行，最好在37℃保温箱内进行，同时也可以测定精于的密度。

用玻棒蘸取一滴原精液或稀释的精液(马、猪、精液密度低不须稀释，牛，羊密度大，需用0．9％氯化钠溶液稀释，其温度相近)，滴在载玻片上，也可滴在载片上翻放于凹玻片的凹窝上，最后置于显微镜下，放大250—400倍检查，显微镜的载物台须放平。并最好在暗视野中进行。

精子的活动有三种类型：前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活率是根据前进运动精子数多少而定。

精子活率=（总精子数～非前进运动精子数）/总精子数 目前评定精子活率等级的方法有两种：

十级制——在显微镜下估计直线前进运动精子所占百分数，直线前进运动精子为100%者评为1．0级：90％者评为0．9级，依此类推。

五级制——全部精子都呈前进运动者属于“5”级，绝大多数精子(约80％)呈前进运动者为“4”级，前进运动的精于略多，于半数者(约60％)为“3”级，不及半数者为“2”级；呈前进运动的精子数目极少者属“1”级。

牛及羊的精液中由于附性腺分泌物少，要求“密5’即密度为“密”，活率为“5”级)及“密4”或“中5”及“中4”一级才能作为输精之用。马与猪的精液中附性腺分泌多，就是“稀5” “稀4”甚至“稀3”的亦可用于输精。

（二）精子密度计数检查

1．介绍血球计数室的构造(用多媒体或投影仪)。 2．介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管(红血球吸管或白血球吸管)。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血球计数器的运用，故不再详述它的结构。

(1)牛、羊、鸡的精液(密度高)用红血球吸管：若将精液吸至“0．5”刻度处，然后再吸3％NaCl至“101”刻度，为稀释200倍。如将精液吸至“1．0”刻度处，再吸3％NaCl至“101”刻度，则为稀释100倍。

(2)猪、马、兔的精液(密度低)用白血球吸管：若将精液吸至“0．5”刻度处，然后再吸3％NaCl至“11”刻度，为稀释20倍。如将精液吸至“1．0”刻度处，再吸3％NaCl至“11”刻度，则为稀释10倍。

3.方法和步骤:

(1)将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数板不掉下来为原则，并且盖玻片在折光时可见到清晰的彩色条纹。

(2)将盖好盖玻片的计数板置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。 (3)用血球吸管吸精液，用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液，并用3％NaCl稀释，因不同的家畜用不同的吸管稀释。

(4)吸管吸好精液和3％NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动，混匀。然后弃去吸管中的前两滴，再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片，也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处，否则，应重新操作。静置2min，开始计数。

(5)镜检和计数：移到高倍镜下检查。

首先数出四角和正中间的五个方格中的精子数，也就是80个小方格中的精子数。载物台要乎置，不能斜放。光线不必过强。

计算精子数：5个方格中共数的精子数×5﹦整个计数室中25个中方格内的精子总数。也就是lmm2×l／10mm﹦1／10 mm3的精子；如果再×10，就为lmm3精液内的精子数；再×1 000﹦l ml精液内的精子数；再X稀释倍数。如果取来的精液本身不是原精液，而是经稀释“X”倍，那么还须再דX”倍。将以上的结果总括起来说：

lml原精液内的精子数﹦5个中方格数的精子数×5×10×1 000×稀释倍数(如果是原精液不要דX”)。

注：(1)一般羊的精子密度为20亿～30亿／ml； 一般牛的精子密度为10亿～15亿／ml；

一般猪、马的精子密度为1亿～1．5亿／ml； 一般兔的精子密度为2亿～3亿／ml； 一般鸡的精子密度为35亿～38亿／ml。 (2)吸管用后清洗步骤：

自来水 蒸馏水 95％酒精 乙醚。

(3)计数板用后清洗方法：

自来水 蒸馏水 白稠布擦干净备用。

(4)也可用移液器稀释。 用移液器吸10 ul精液十1 990ul(在小试管内先加2ml，再吸出10 ul)的3％NaCl，即稀释200倍。同样，20 ul精液用1 980 ul的3％NaCl稀释，即稀释100倍。以此类推。

还有其他方法，如在10ml离心管中，加0．5ml精液，再用NaCl稀释至10ml，即稀释20倍。

(5) 也可用2％伊红溶液稀释精子，既杀死精子又使精子头部着色，使

计数容易。

4.注意事项

(1)若精子压计数室的线，则以精子头为准，按照“数上不数下，数左不数右”的原则计数。

(2)为了减少误差，应对同一样品做2～3次重复，求其平均值。如果计数的结果相差较大，则应进行再次检查。

（三）理化因素对精子的影响

1.精液样品的稀释和压片标本的观察 在本实验中，凡精液需稀释时，一律在载玻片上进行稀释，即先在载玻片上滴一滴精液，再滴——滴指定的其它液体，混匀后制成压片标本。以原精液或以6％葡萄糖溶液稀释的精液制成的压片标本作对照用。

将制作好的精液压片标本直接或经规定的处理以后，置于400、600倍显微镜下仔细观察观察精子的运动状态和形态，并评定出精子的活率。

2．温度的影响

(1)用原精液制一压片标本，装入密闭的标本瓶中，迅速放入5～0℃以下的冰箱(或装有冰块的广口保温瓶)中3～4分钟，然后取出在室温下镜检。

(2)制一压片标本放在55℃恒温培养箱中，3分钟后取出镜检。

(3)制—压片标本缓慢地降温至15～12℃立即镜检；然后将其放在酒精灯火焰上方5～7厘米处以钟摆速度左右拉动3～4次升温后镜检。

3.PH值的影响

取一滴原精液滴于载玻片上，滴加—滴3％碳酸氢钠液制成压片标本；另取一滴精液滴加3％柠檬酸液制成压片标本，在室温下放置2～3分钟后镜检。然后，以同样方法各稀释一滴精液，用试纸测出其pU值以便于进行记录。

4.渗透压的影响

取两块载玻片，各在其两端分别滴一滴原精液，再分别滴以0．9％氯化钠液、3％氯化钠液、6％葡萄糖液和蒸馏水，制成压片标本镜检。

5.消毒剂的影响

各滴一滴原精液于载玻片上，制成压片后镜检；然后分别揭开盖玻片，每个标本片上滴一滴下列药液(只滴一种)后再做一次镜检：

(1)肥皂水；

(2)2％来苏儿液；

(3)0．1％新洁尔灭液； (4)75％酒精溶液。

6.光照的影响 取一滴精液制成压片标本后立即镜检；然后将其置于日光下曝晒10分钟以上再次镜检。

7.振荡的影响 取一滴精液制成对照标本片，将剩余的精液剧烈振荡3、5分钟后制片镜检。