离子色谱积分脉冲安培法同时测定血浆中阿仑膦酸钠_帕米膦酸钠_伊班膦酸钠和利塞膦酸

ChineseJournalofChromatography

Vol．30No．4

414～418

DOI：10．3724/SP．J．1123．2011．12070

第五届亚太地区离子分析会议论文

离子色谱积分脉冲安培法同时测定血浆中阿仑膦酸钠、

帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠

陈

1223*

郁，刘玉秀，陈智栋，陈梅兰，朱

岩

4

（1．杭州职业技术学院，浙江杭州310018；2．常州大学化学化工学院，江苏常州2131；3．浙江树学生物与环境工程学院，浙江杭州310015；4．浙江大学化学系，浙江杭州310028）摘要：建立了离子色谱积分脉冲安培检测器（IPAD）同时检测血浆中阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠的方法。采用DionexAS18（250mm×2mm）和AG18（50mm×2mm）色谱柱在24mmol/LNaOH溶液中进行分离；对多电位波形参数优化以达到最大信噪比；采用优化后的波形方法对4种双膦酸盐类药物进行检测，

2

具有良好的线性（r为0.9972～0.9995）和重现性（峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.84%～1.37%）及较高的灵

与之前报道的敏度（检出限为0.061～0.18μg/mL）。4种双膦酸盐在该方法中有很好的保留且有较好的分离度，

衍生后检测方法相比，该方法不用衍生，更简单而易于操作。将该方法成功地用于人体血浆中双膦酸盐类的检测，其回收率为80.81%～97.32%，RSD为1.46%～3.02%。

关键词：离子色谱；积分脉冲安培检测；阿仑膦酸钠；帕米膦酸钠；伊班膦酸钠；利塞膦酸钠；血浆中图分类号：O658

文献标识码：A

8713（2012）04-0414-05文章编号：1000-

Simultaneousdeterminationofalendronate，pamidronate，

ibandronateandrisedronateusingionchromatography

withintegratedpulsedamperometricdetection

CHENYu1，LIUYuxiu2，CHENZhidong2，CHENMeilan3*，ZHUYan4

（1．HangzhouVocationalandTechnicalCollege，Hangzhou310018，China；

2．SchoolofChemistryandChemicalEngineering，ChangzhouUniversity，Changzhou2131，China；3．CollegeofBiologyandEnvironmentEngineering，ZhejiangShurenUniversity，Hangzhou310015，China；

4．DepartmentofChemistry，ZhejiangUniversity，Hangzhou310028，China）

Abstract：Amethodforthesimultaneousdeterminationofalendronate，pamidronate，ibandr-onateandrisedronateusingionchromatographywithintegratedpulsedamperometricdetection（IPAD）hasbeendeveloped．Theelectrochemicalbehaviorshowedthecatalyticcurrentsofthesebisphosphonatesarebasedontheoxidationofaminesintheirstructures．Becausethebisphosphonatesarepolarcompoundsandpresentasanionsunderalkalinecondition，therefore，theycanbeseparatedbyanionexchangechromatography．ADionexAS18column（250mm×2mm）andanAG18column（50mm×2mm）and24mmol/LNaOHsolutionwereusedfortheseparation．Multi-steppotentialwaveformparameterswereoptimizedtomaximizethesignal-to-noiseratio（S/N），whichexhibitedadsorption/desorptioncatalyticfeaturesatthegoldelectrodesurfaceinalkalinesolution．Utilizingtheoptimizedwaveform，themethodshowedgoodlinearity（r2=0.9972－0.9995），satisfactoryrepeatability（relativestandarddeviations（RSDs）ofthepeakareasintherangeof0.84%－1.37%）andsufficientsensitivity（limitsofdetectionof0.061－0.18μg/mL）fortheidentificationofthefourbisphosphonates．Therecoverieswere80.81%－97.32%withtheRSDsof1.46%－3.02%．Itisdemonstratedthatthismethodisarapidandsim-pleoneforthedeterminationofthefourbisphosphonatesinhumanplasma．

*通讯联系人：陈梅兰，mail：rain-lake@163．com．教授，研究方向为环境化学．Tel：（0571）88297103，E-基金项目：浙江省自然科学基金一般项目（Y2110945）和浙江省科技计划项目（2011C37065）．12-26收稿日期：2011-

第4期

陈

郁，等：离子色谱积分脉冲安培法同时测定血浆中阿仑膦酸钠、

帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠

·415·

Keywords：ionchromatography（IC）；integratedpulsedamperometricdetection（IPAD）；alendronate；pamidronate；ibandronate；risedronate；plasma双膦酸盐是一类广泛用于治疗骨骼病症的化合

［1］

物，包括恶性高钙血症、骨质疏松和佩吉特氏病。最常见的口服含氮制剂的副作用是胃部不适和食管

［2］

C-P结构，炎症。该类化合物是具有P-两个膦酸基团之间连接一个碳原子（见图1）。双膦酸盐如阿

仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦钠和利塞膦酸钠均为极性化合物，这使得其在非极性固定相如C18或C8柱上很难保留。另外，由于其缺乏生色基团，没有紫外吸收和荧光，因而不易被检测。双膦酸盐不适合用气相色谱（GC）分析，因为其挥发性低，且有离子的性质，易导致峰展宽和峰不对称

［3］

碱性条件下可直接离；而且结构中都包含胺基基团，

在金电极上氧化。本研究建立的离子色谱积分脉冲IPAD）可同时测定阿仑膦酸钠、帕安培检测法（IC-米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠。实验结果表明该方法是简单快速测定人体血浆中的4种双膦酸

盐的一种新方法。

1

1．1

实验部分

仪器和试剂

DX-600离子色谱仪，LC25配有GP50梯度泵、

。

色谱柱温箱和ED50A电化学检测器，数据采集系统为Chrome6.8的变色龙软件（Dionex公司）。阿仑膦酸钠（纯度98%）、帕米膦酸钠（纯度99%）、伊班膦酸钠（纯度98%）和利塞膦酸钠（纯度98%）（中国药物生物样品研究所）。HPLC级乙腈（Tedia公司）。所用氢氧化钠溶液由50%（质量分数）氢氧化钠储备液配制。其他试剂均为试剂纯。实验用水为Q水纯化电阻率为18.2MΩ·cm（由Milli-超纯水，

EVAP-12氮吹仪系统制备）。OrganomationN-（OrganomationAssociates公司）。固相萃取柱：DionexOnGuardIIRP柱（2.5mL，Dionex公司）。无药品人体血浆由浙江省血库提供。

Fig．1

图1双膦酸盐的化学结构

Chemicalstructuresofbisphosphonates

阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠储备液由超纯水配制并置于4℃冰箱中保存。其工作溶液通过水稀释储备液得到，于4℃冰箱中保存。1．2

色谱条件

实验采用填有阴离子交换树脂的DionexAS18柱（250mm×2mm）和AG18柱（50mm×2mm）；NaOH溶液浓度为24mmol/L，流速为0.25mL/min；进样量为10μL；检测温度为30℃；通过Ag/AgCl为参比电极配有金电极为工作电极和pH-的检测池检测。1．3

样品前处理

在4mL离心管中以400μL水稀释400μL血浆，加入800μL乙腈沉淀蛋白质，漩涡振荡器上充分混合1min，以10000r/min离心10min。收集上层清液，于30℃水浴中在氮气流下吹干，残渣中加入400μL水溶解后加载到RP柱（预先过5mL10mL水，乙腈、静置活化30min），以2mL水冲洗RP柱，洗脱液过0.45μm滤膜后直接进样分析。

由于双膦酸盐的口服剂量较小（通常为10～20

mg），因此在人血浆中的浓度很低。为了更有效地需要更为灵敏的方法对其在血研究其药代动力学，

尿液样品中的含量进行有效准确的测定。近几液、

年国内外分析血浆、尿液样品中双膦酸盐的方法主HPLC）［4－10］、要有反相高效液相色谱法（RP-离子对

［10，11］

和离子色谱法高效液相色谱法（IPC）

（IC）［12－14］等，涉及的检测器主要有荧光检测器

［4－7］

［8，9］［12－14］

、、质谱检测器紫外检测器等。这些

方法主要通过柱前衍生方法得到较低的检出限，最低可达1～5ng/mL；所用的衍生试剂主要包括芴甲

［4－7，10］［8］

、氧羰酰氯（FMOC）氯甲酸异丙酯（IBCF）

和Fe

3+［12，13］

等。

衍生化反应的缺点包括其步骤复杂，耗费时间，

其衍生物可能不稳定。由于阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠在碱性条件下可电离为阴离子，因此可以用阴离子交换色谱法（AEC）分

·416·

色谱第30卷

2

2．1

结果与讨论

金电极上的伏安响应

通过循环伏安法研究阿仑膦酸钠在氢氧化钠溶

果。波形图包括3个区：吸附/引发（电位E1/E2）、E4）和清洗/活化（电位E5/E6），积分（电位E3、其中E1、E2和E3是影响检测灵敏度的重要因素。

以0.2μg/mL4种双膦酸盐混合溶液为标准，将E1从－0.4到－0.15V以0.05V为间隔变化，E1对S/N的影响如图3a所示。从图3a中可看出，除了伊班膦酸钠的最大响应在－0.25V外，其他双综合考虑选择E1=膦酸盐的最大响应在－0.3V，

－0.3V。固定E1=－0.30V，E2从－0.25到－0.05V变化，4种双膦酸盐的最大如图3b所示，因此选择E2=－0.15V。使E1响应均在－0.15V，

=－0.30V，E2=－0.15V，从0.15到0.30V优化E3，如图3c所示，最佳值为E3=0.22V。实验采用的波形如表1所示。图4显示了在最优条件下0.1μg/mL阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠混合标准溶液的色谱分离图。

测定阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠的积分脉冲安培电位波形

Table1WaveformspecificationsofIPADforthe

determinationofalendronate，pamidr-onate，ibandronateandrisedronateTime/s0．000．040．050．210．220．460．470．560．570．580．59

Potential（vsAg/AgCl）/V

－0．30－0．30－0．15－0．150．220．22－0．15－0．15－2．00－2．000．60

endbeginIntegration

表1

液中的金电极的伏安响应。图2显示了阿仑膦酸钠在0.10mol/LNaOH溶液中的金电极的循环伏安图。在正向扫描时，在0.40V附近的氧化峰（AuOH和AuO）是电极表面生成的氧化物所形成的。反向扫描时，在0.20V附近的还原峰是由于表面氧化物的还原形成的，而在－0.2V的峰是由溶解氧还原造成的。在10mg/L阿仑膦酸钠（实线）存在下，观察到阳极电流增加，可能是其氧化与表面氧化物的形成同时发生（正向扫描）。发现在0.1V和0.3V之间有氧化物形成产生的阳极峰。观察其他化合物如帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠（数据未显示）也有类似的伏安响应。

图20.10mol/LNaOH中金电极的循环伏安图

Fig．2VoltammetricresponseatAuelectrode

in0.10mol/LNaOHsolution

Scanrate：50mV/s．

循环伏安图中显示的结果与Johnson和La-Course［15］记载的胺类化合物在金电极上的电化学反应一致，这些化合物以氮原子的非成键电子对吸吸附物被氧化脱附，附在金表面上。在碱性条件下，

与金的氧化物的形成过程同时发生，氧化形成的中OH）可作为催化活性中心催化金电极间产品（Au-表面的分析物的电化学氧化。从上述结果中可看出，在金电极上检测4种双膦酸盐类药物是可行的。2．2

IPAD波形优化

多电位波形应用于干净和有活性的电极表面，能够提高信噪比（S/N）。本实验优化了在离子色谱中积分脉冲安培检测4种双膦酸盐6电位波形，以S/N为被优化参数的函数，做图优化得到最优化结

2．3线性方程、检出限和精密度

排除基质效应对定量干扰的最好方法是采用基

质匹配方法制备工作曲线或采用内标法。实验中比较了直接配制和用空白血浆配制的相同浓度的标准溶液，得到的结果显示无基质效应，且加标回收率显故本文用直接配制的混合标准溶液制示结果较好，

备工作曲线。精密量取标准储备液配制阿仑膦酸钠0.02、0.05、0.1、0.2、和帕米膦酸钠分别为0.01、

0.5、0.8μg/mL，伊班膦酸钠和利塞膦酸钠分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0μg/mL的混合标以峰面积Y对分析物质量浓度X（μg/mL）准溶液，

进行线性回归，其线性方程、线性范围、相关系数、定量限、检出限及精密度见表2。

第4期

陈

郁，等：离子色谱积分脉冲安培法同时测定血浆中阿仑膦酸钠、

帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠

·417·

Table2

IPAD法检测4种双膦酸钠标准溶液的线性方程、表2AEC-线性范围、相关系数、定量限、检出限及精密度

2

Calibrationcurves，linearranges，correlationcoefficients（r），limitsofquantification（LOQs，S/N≥10），limitsofdetection（LODs，S/N≥3）andprecisions（RSDsofpeakareas）fordeterminationofpamidronate，alendronate，ibandronate，risedronatebyanionexchangechromatography-integratedpulsedamperometric

IPAD）detection（AEC-CalibrationcurveY=0．9919X+0．0028Y=0．9928X+0．0028Y=0．9967X+0．0014Y=0．9717X+0．0099

Linearrange/

（μg/mL）0．01－0．800．01－0．800．02－1．000．02－1．00

r20．990．99950．99720．9991

LOQ/（ng/mL）5．4810．018．1217．21

LOD/（ng/mL）1．663．022．465．21

RSD/%

Intra-day（n=5）

1．030．841．371．07

Inter-day（n=3）

3．341．873．652．94

AnalytePamidronateAlendronateIbandronateRisedronate

Y：peakarea；X：massconcentration，μg/mL．

图44种双膦酸盐混合标准溶液（0.1μg/mL）的色谱图Fig．4TypicalAEC-IPADchromatogramofamixed

standardsolutionof0.1μg/mL

Column：DionexAS18（250mm×2mm）plusaguardcol-umn；eluent：24mmol/LNaOHsolutionataflowrate0.25mL/min．

Peaks：1．pamidronate；2．alendronate；3．ibandronate；4．risedronate．

回收率及相对标准偏差（RSD）列于表3。实际加标样品中阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠的检出限（按信噪比（S/N）≥3计）分别为0.061、0.13、0.075、0.18μg/mL；定量限（S/N≥10

0.22、0.19、0.27μg/mL。图5为计）分别为0.13、

血浆中加入5μg/mL阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊

班膦酸钠和利塞膦酸钠稀释10倍后的色谱图。

图3Fig．3

（a）E1、（b）E2和（c）E3对信噪比的影响Effectsof（a）E1，（b）E2and（c）E3

0.2

onthesignal-to-noiseratio

Massconcentrationsofthefourbisphosphonates：μg/mL．

2．4加标血浆样品的测定

1、0.5μg/mL的阿分别在空白血浆中加入5、

仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠，样品处理后稀释10倍，平行测定5份样品，得到的

图5人体血浆中添加4种双膦酸盐（0.5μg/mL）的色谱图

Fig．5TypicalAEC-IPADchromatogramofhumanplasma

spikedwith4bisphosphonatesat0.5μg/mL

Forpeakidentifications，seeFig．4．

·418·

表3

色谱参考文献：

［1］ColemanRE．Oncologist，2004，9（4）：14

第30卷

人体血浆中添加阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠

和利塞膦酸钠的回收率（n=5）

Table3Recoveriesofpamidronate，alendronate，

ibandronate，risedronatespikedinaplasmasample（n=5）

Added/（μg/mL）0．500．10．050．500．10．050．500．10．050．500．10．05

Found/（μg/mL）0．460．0910．0430．450．0880．0410．480．0950．0420．440．0830．040

Recovery/

%92．0191．0286．0390．2888．0482．0797．3295．3284．88．3783．2680．81

RSD/%1．461．521．831．712．012．401．1．942．242．132．573．02

［2］ZavrasAI．AnnNYAcadSci，2011，1218：55

［3］SantosFJ，GalceranMT．TrendsAnalChem，2002，21：

672

［4］LuTL，HuHJ，ZhaoW，etal．JLiqChromatogrRelated

2010，33：349Technol，

［5］MengJ，MengQ，ZhengLY．BiomedChromatogr，2010，

24：169

［6］ApostolouC，DotsikasY，KousoulosC，etal．JPharmBi-omedAnal，2007，43：1151

［7］Perez-RuizT，Martinez-LozanoC，Garcia-MartinezMD．J

ChromatogrA，2009，1216：1312

［8］TarcomnicuI，SilvestroL，SavuSR，etal．JChromatogr

2007，1160：21A，

［9］WarnkeMM，BreitbachZS，DodbibaE．AnalChimActa，

2009，633：232

［10］JiaHJ，LiW，ZhaoK．AnalChimActa，2006，837：112［11］DeebSK，HamdanII，NajjarSM．Talanta，2004，：695［12］TarcomnicuI，GheorgheMC，SilvestroL，etal．JChrom-2009，877：3159atogrB，

［13］KuljaninJ，JankovicI，NedeljkovicJ，etal．JPharm

2002，28：1215BiomedAnal，

［14］FernandesC，LeiteRS，LanasFM．JChromatogrSci，

2007，45：236

［15］JohnsonDC，LaCourseWR．AnalChem，1990，62：5

AnalytePamidronate

Alendronate

Ibandronate

Risedronate

3结语

IPAD是一种检测血浆中实验结果表明AEC-阿仑膦酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠简单快速的方法，可用于血浆中该类药物残留分析

的快速定量。4种双膦酸盐在该方法中有很好的保留且有很好的分离度，与之前报道的衍生后检测方

该方法不用衍生，更简单而易于操作。法相比，