生物化学与分子生物学技术 重点试题归纳

1、 说出三种蛋白质得测定方法，若您选择，您会选择哪一种？为什么？

答：双缩脲法、lowry改良法、考马斯亮蓝（Bradford）法、BCA（二喹啉甲酸）法、紫外线分光光度法。我会选择BCA法。双缩脲法灵敏度差，特异性不高。Lowry改良法对样品得溶解度要求高、易受物质干扰且容易产生测量误差。紫外线分光光度法得精确度差。而BCA法则能较好地弥补以上方法得缺点。它具有操作便捷快捷、精确度高、抗干扰能力强、能使用于微板孔等特点。

2、 western blot印记中封闭液得作用？

答：封闭液可以结合非相关蛋白得位点以降低非特异性结合得背景。

3、 γ球蛋白得提取过程。

答：（1）盐析—中性盐沉淀：

通过加入半包与硫酸铵可以使球蛋白沉淀，清蛋白留在溶液中。得到γ球蛋白粗制品。

（2）脱盐—凝胶柱层析：

经过凝胶柱层析，使得大分子得蛋白质与小分子得盐分离。

（3）纯化—DEAE纤维素阴离子交换层析

用阴离子交换层析可以把在PH=6、3得缓冲液中得带负电得α、β球蛋白与带正

电得γ球蛋白分离。使γ球蛋白被洗脱出来被纯化。

（4）经过浓缩得到浓度高得γ球蛋白

4、离子交换剂得原理

答：离子交换剂就是一种在高分子得不溶性载体上结合有若干活性基团，这些活性基团含可解离得离子并与溶液中得其她离子进行交换。

5、 如果western blot中出现两条带，就是否说明有杂质？为什么？

答：并不说明有杂质。因为在实验中我们得检测对象就是人血清IgG，IgG就是由两条轻链与两条重链通过二硫键结合起来，变形后轻、重链分开，形成两条带（21KD、57KD）

6、 分别简述DNA提取中蛋白酶K、SDS、无水乙醇、RNase得作用

答：蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

SDS：破坏细胞得细胞膜、核膜并使组织蛋白与DNA分子分离

无水乙醇：可以使DNA沉淀

RNase：可以去除溶液中得RNA

（EDTA：抑制细胞中得DNase活性）

7、 试述转化质粒蓝白筛选得原理。

答：载体质粒DNA带有b-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（α片段）得编码信息，经过改造得宿主菌含有b-半乳糖苷酶C端（ω片段）得序列。只有当两个片段都存在得时候才能形成有活性得b-半乳糖苷酶（这种现象称为α-互补）。b-半乳糖苷酶在IPTG得存在下可以使底物X-gal转变为蓝色产物，使菌落变为蓝色。当外源DNA片段插入载体得多克隆位点后。便不能表达α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落呈现白色。α互补筛选又称为蓝白筛选。

8、 简述RT-PCR原理及核酸类型。

答：首先，经逆转录酶得作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目得片段。

实验中所加入得特殊试剂

聚丙酰胺凝胶电泳：P47-48、53

1、TEMED（三羟甲基氨基甲烷）：加速剂，在碱性环境下处于自由碱基得状态并加速过硫酸铵得作用。

2、AP（过硫酸铵）：产生自由基，使丙烯酰胺单体双链打开，形成自由基丙烯酰胺，引发聚合反应。

3、水层：在胶面封以水层可以避免直接与空气接触（O2能妨碍聚合），也可以使胶面变得平整。

4、考马斯亮蓝：染色液

5、溴酚蓝：样品示踪染液

6、蔗糖溶液：保证样品得稳定性，不易悬浮在液体中。

7、A液：Acr-Bis

B液：浓缩胶缓冲液

C液：分离胶缓冲液

D液：电极缓冲液

E液：1%过硫酸铵溶液

8、EB（溴化乙锭）：核酸染色剂，可插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，在紫外线得激发下发出橙光。

9、硫基乙醇：使二硫键还原。

DNA琼脂糖凝胶电泳：P56~57

*1、TBE：Tris-硼酸，EDTA（抑制细胞中得DNase活性）

Western blot：P61~63

1、封闭液：封闭膜上可能结合非相关蛋白得位点，降低非特异性结合得背景。本实验用得就是牛血清白蛋白。 2、辣根过氧化物酶（HRP）：标记羊抗人IgG抗体

3、3,3’-一二氨基联苯胺：HRP底物

4、考马斯蓝：用于凝胶，检查蛋白质转移就是否完全。

5、丽春红S：用于NC膜上，可将蛋白质染红，短暂显色，判断就是否有转移出蛋白质。

6、TBS：成分NaCl,Tris,HCl，用作缓冲液。

酶动力反应：P77、P84

1、磷酸苯二钠：被碱性磷酸酶水解成酚与磷酸盐。

2、4-氨基安替比林：与酚在碱性溶液中作用形成红色得醌衍物。

3、铁：催化酚与4-氨基安替比林反应

质粒DNA提取：P91~94：

*1、溶液I：Tris-Hcl：控制PH。

EDTA：二价金属离子得螯合剂，可抑制Dnase得活性

葡萄糖：提高溶液黏度，防止DNA断裂，比重大，使细菌不易沉淀

*2、溶液II：NaOH：溶解细胞

SDS：当溶液III进入时，SDS与K+结合变为PDS，PDS不溶于水沉淀。因SDS可结合2个氨基酸。所以PDS沉淀时使绝大部分蛋白质一起沉淀。

*3、溶液III：乙酸钾：提供K+

冰乙酸：同上

*4、TE：含RNase 用于消除RNA（质粒DNA提取提及）

含Tris-HCl, EDTA（基因组DNA得提取）

5、饱与酚：使蛋白质变性沉淀

6、酚：氯仿，用于萃取酚

基因组DNA得提取：P93~94

*1、蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

*2、SDS：破坏细胞得细胞膜、核膜并使组织蛋白与DNA分子分离

*3、AR（无水乙醇）：可以使DNA沉淀

*4、RNase：可以去除溶液中得RNA

5、70%乙醇：用于洗涤质粒DNA沉淀，除去盐分

RNA得提取：P100~102

*1、Trizol试剂：异硫氰酸胍：在溶解细胞时保持RNA完整，使RNA释放，酸性条件下使得RNA与DNA分离

苯酚：沉淀蛋白质

2、氯仿：使溶液变成三层（RNA/DNA/蛋白质）

3、异丙醇：沉淀RNA

4、DEPC（焦碳酸二乙酯）：可消除RNase

性内切酶：

1、 DTT（二硫苏糖醇）：还原剂

DNA得转化与筛选：P109~110

1、X-gal：底物

2、CaCl2：增加细胞膜得通透性

3、甘油：灭菌

4、IPTG：诱导剂，让细胞产生更多半乳糖苷酶

血清γ球蛋白提取：P114~115

*1、半饱与硫酸铵：沉淀球蛋白，使球蛋白与清蛋白分离

*2、DEAE纤维素阴离子交换剂：将α、β球蛋白与γ球蛋白分离

*3、磺基水杨酸：检测蛋白质，白色即有

*4、奈氏试剂：检测NH4+，黄色或红棕色即有

另外

归纳SDS：

1、 阴离子去污剂，可以破坏蛋白质分子间以及其她物质分子间得非共价键，使得蛋白质变性解离成单一亚基，形成SDS-蛋白质负离子。（SDS-PAGE）

2、破坏细胞得细胞膜、核膜并使组织蛋白与DNA分子分离（基因组DNA得提取）