外泌体在骨性关节炎治疗中的研究进展

细胞分泌的外泌体治疗骨性关节炎可有效修复关节软骨，促进软骨组织再生。外泌体可通过蛋白质以及核酸等

生物大分子的转运来介导细胞信号转导，并将其所携带的生物活性物质释放，减轻炎症反应并改善关节软骨周

围微环境，从而发挥治疗骨性关节炎的作用。本文就当前在外泌体领域对骨性关节炎以及软骨修复的最新实验

结果进行讨论，并提供一些新观点和设想。［关键字］外泌体；骨性关节炎；间充质干细胞［中图分类号］R684.3

Progress in the treatment of osteoarthritis by exosome［文献标识码］AWang Jifeng', Duan Li； Li Yaoxi2, Wang Daping12. 1 Guangzhou Medical University, Guangzhou Guangdong, 511436; 2 Shenzhen Key Laboratory ofTissue Engineering, Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intel­

ligence andDigital Orthopedic Technology, Shenzhen SecondPeople'sHospital (The First AffiliatedHospital of Shenzhen

University), Shenzhen Guangdong, 518035, China[Abstract] With the development of aging society, osteoarthritis has seriously affected the quality of life of the elderly.

At present, a large number of studies have shown that the exosome secreted by mesenchymal stem cells can effectively

repair articular cartilage in osteoarthritis and promote cartilage regeneration. Exosomes transport proteins and nucleic ac・ ids to mediate cell signal transduction, release the bioactive substances it carries, alleviate inflammation and improve microenvironment around articular cartilage, and to play a role in the treatment of osteoarthritis. This paper discusses

the latest experimental results of osteoarthritis and cartilage repair in the field of exosome with providing some new ideas and assumptions.[Key words] Exosome; Osteoarthritis; Mesenchymal stem cells随着人口的老龄化，骨性关节炎(osteoarthritis, OA)

已经成为致残的重要原因之一，且发病率逐年上升，被称为

进展做_综述。1外泌体概述1.1外泌体的概念外泌体(exosome, EXOs)是一种由细胞分泌的，直径 为30〜150 nm的具有磷脂双分子层结构的膜性扁平杯碟状

不治之症。OA的发病机制十分复杂，正常人的关节软骨属

于透明软骨，软骨细胞占关节软骨体积的1%〜5%,其可

分泌II型胶原、透明质酸等成分，维持细胞外基质的代谢平

衡。当年龄增大时，关节软骨发生退行性纤维病变，弹性降 低，生理结构发生改变，软骨细胞发生过度增殖及肥大化,

最终导致不能正常合成聚氨基葡萄糖及透明质酸，从而导致 软骨降解及基质的丢失叫外泌体是一种由细胞分泌的微囊

的微囊小泡，其包含核酸、蛋白质等多种生物活性物质。最

初人们认为这些囊泡状物质是细胞排泄的废物，但随着科学

研究的不断深入，人们发现这些微囊泡在生物体细胞及系统 间的通迅交流中起到极其重要的作用叫与传统信息信号途

泡,其在人体中的细胞或系统之间的交流、调节人体内环境

稳态及对一些疾病的影响起到重要作用。最新研究表明，不

径相比，EXOs是一种细胞之间更高等级的交流方式，其作

为载体可将miRNA.mRNA及蛋白质等多种大分子或小分子

运送到靶细胞中，从而参与人体细胞或系统间的作用叫

同细胞来源的的外泌体在骨性关节炎疾病的发生、发展中起 到十分重要的作用。本文就外泌体在骨性关节炎治疗的研究 *基金项目：国家自然科学基金(81772394);广东省自然科学基金

(2018B0303110003)1.2外泌体的分离EXOs是通过多泡体与质膜或浆膜融合形成的，直径为

30〜150 nm,而微囊泡的形成则是从质膜上脱落，直径为

作者单位：1广州医科大学，广东广州,511436; 2深圳市组织工程重点实验

室,广东省智能化数字骨科工程技术研究中心，诛圳市第二人民医院(深圳大

100〜1 000 nmo 2009年，布鲁诺等将MSC的分泌物对甘油

所致的急性肾损伤的改善作用归因于微囊泡(80 nm到1 pm

学附属第一医院)，广东深圳.5180352019年 10月第16卷第5期生物骨科材料与临床研究Orthopaedic Biomechanics Materials And Clinical Study.61.之间)的作用。而相比较之下，Lai等凶认为这是外泌体起

到了保护的作用。这是一种内源性的囊泡，并具有外源性的

相关蛋白，如 Alix、TGS101 及 CD9、CD63 和 CD81 等。由于研究EXOs的功能结构需要排除病毒或其他杂质蛋白的 影响，故如何能最大化地除去杂质来保证分离出外泌体的纯

度成为关键。而不同的EXOs提取方法所获得EXOs无论从 纯度还是从粒子的完整性方面差异均较大。目前，EXOs的

提纯分离方法主要分为以下几种：①蔗糖密度梯度离心法; ②差速超速离心法；③化学沉淀法；④凝胶过滤法；⑤免疫 亲和法。Labb等a认为，使用化学沉淀法来提取EXOs虽

然可以获得大量颗粒，但纯度不够，即所得产物中虽然有大

量蛋白质，但都不属于EXOs。而超速离心法可以很好地达 到纯度要求,但由于转速过快导致易破坏EXOs表面囊泡状 膜结构。此外一些研究表明，可利用免疫亲和法来获取

EXOSo抗体通过共价键或高亲和力与磁珠相互作用，通过

低速离心或磁性技术来进行物理分离。Sharma等［6］开发出

了一种新的基于免疫亲和的方法来从患者血浆中的正常细胞

分泌的EXOs中分离黑色素瘤细胞分泌的EXOs (MTEX).1.3外泌体的鉴定目前对于EXOs的鉴定主要在如下的几个方面：①在

透射电子显微镜下进行EXOs的形态学观察，可观察到明显 的一群直径在30〜150nm之间的杯碟状小囊泡，其周围有

明显的膜性结构。②流式细胞技术检测EXOs的共性表面的

蛋白质标记，典型的EXOs膜蛋白主要有CD9、CD63、GA-

PDH以及MFGE8、热休克蛋白等。一般来说，不同细胞分

泌的外泌体中都含有其母体细胞的的表面标记物。③利用光

学单粒子跟踪技术对EXOs的数量和浓度以及粒径分布进行 示踪，利用CCD摄像机对外泌体所做的布朗运动进行记录,

用斯托克斯-爱因斯坦方程计算每个粒子的平均速度，从而

精准定量囊泡的数量和大小叫实验中仅通过投射电镜观察 或流式检测并不能准确鉴定EXOs,因此通常需要这几种方

法联合应用，以达到更加精确鉴定EXOs的目的。2外泌体在骨性关节炎中的应用研究进展2.1外泌体在骨性关节炎诊断中的研究进展炎症是OA滑膜炎导致骨和软骨破坏的进展过程的关 键因素之一。炎症过程所产生的一系列促炎细胞因子、趋

化因子及一些基因的表达在OA的发病机制中起到了特殊

作用181 = Domenis等的研究表明，滑膜液(synovial fluid,

SF)来源的外泌体可以刺激外周血单核细胞分化的炎性Ml

巨噬细胞分泌IL-邛和IL-16 ［9］,而IL-邛在OA发病机制中

的关键作用已被广泛认识，IL-邛在OA滑膜液中的水平显

著升高，这可使其在OA诊断中起到生物标记物的作用阿。

而且，IL-邛在参与OA发病机制中的细胞级联反应中的上

游发挥作用，其可诱导其他几种促炎反应因子(如IL-6和

IL-8)的表达和释放，以及基质金属蛋白酶的合成。在这项

研究中，Domenis等还发现SF分泌的外泌体能刺激Ml型 巨噬细胞产生CCL-20, CCL-15和CXCL1等趋化因子。

CCL-20能通过诱导相关分解基因的表达和改变软骨细胞表

型来发挥作用，其刺激MMP-13, ADAMTS-5和COL-X型

mRNA的表达，同时抑制新鲜的体外培养的软骨组织中 COLII型mRNA的表达［11］；而CXCL1在OA软骨细胞中

表达上调MI,其可诱导软骨细胞肥大和凋亡。SF分泌的外 泌体还能刺激Ml巨噬细胞释放MMP7和MMP12.这两种 蛋白酶据研究发现与OA严重程度密切相关叱切。MMPs是

导致软骨降解的主要酶，而软骨细胞外基质的降解是OA的 最本质的特征。以上研究说明，外泌体作用于细胞后产生的

相关细胞因子可以为诊断骨性关节炎提供一个新思路。

2.2外泌体在治疗骨性关节炎中的研究目前，对于人胚胎干细胞诱导的间充质干细胞(ESC-

MSCs)来源的EXOs对骨性关节炎的防治作用机制研究颇

为深入。Wang等1141发现，向C57小鼠关节腔里注射ESC-

MSCs可以减轻DMM模型中的软骨破坏和细胞外基质的降

解。这种作用最终被确定为是ESC-MSCs分泌的EXOs发

挥的作用。在IL-邛的存在下，EXOs通过增加II型胶原的

合成以及提高ADAMTS5的表达来维持软骨细胞的表型，即

ESC-MSCs可以通过EXOs来平衡软骨细胞外基质的合成和

降解，达到治疗OA的作用，这为OA的防治以及药物开发 提供了一个崭新的思路。有体外实验证明，在具有免疫活性

的大鼠软骨缺损模型中，人间充质干细胞分泌的EXOs可促 进其软骨再生阿。结果显示，MSCs-EXOs可加速软骨组织

的填充以及增强了 II型胶原蛋白和硫酸糖胺聚糖等基质的合 成。EXOs处理过的大鼠软骨和软骨下骨完全修复，表面规 则，具有透明软骨的特征。这种透明软骨可以与周围的正常

软骨相紧密结合，浑然一体，并观察到有大量的细胞外基质 沉积。2.3外泌体与骨性关节炎的微环境有研究表明，低氧是骨性关节炎形成的一个重要因素。 其中，低氧诱导因子la (HIF-la)通过激活低氧反应元件 被认为是细胞适应低氧和分解应激的关键调节因子悶。通

过诱导相关合成因子和抑制一些关键的分解因子来维持和调

节软骨紊态。例如，HIF-la可促进COX-2、CXCL-2及IL-1、

IL-6的合成，从而引发骨性关节炎微环境中的炎症反应,

HIF-la通过NF-Kp/HIF-la信号通路上调MMP2和MMP9的

表达。这也说明关节液和软骨组织中的HIF-la在OA的发

病机制中起到了重要作用。有研究表明，在TNF-a诱导的软

骨细胞凋亡中,HIF-la修饰的骨髓间充质干细胞来源的外泌

生物骨科材料与临床研究.62.Orthopaedic Biomechanics Materials And Clinical Study2019年10月第16卷第5期体(BMSC-EXOs)对关节软骨损伤具有修复作用，其可抑 制炎症环境中软骨细胞的凋亡[171=上述骨性关节炎微环境的变化也与软骨细胞分泌的

EXOs载有的一些蛋白质和微小RNA有关阿。MiRNA是一

种单链的非编码的小分子，长度为20个核昔酸左右，其可

影响OA的炎症反应过程，MSCs-EXOs中含有大量的miR-

NA,这在MSCs-EXOs治疗外泌体中发挥着重要作用，如 miR-92a可通过增强软骨细胞增殖、诱导软骨形成而达到治

疗OA的目的网。MiR-320则可以增加软骨细胞ECM合成

并下调负性调节因子(如MMP-13和ADAMTS-4)的表达 来减轻OA的发生閃。最近有研究发现，miR-146加重了促炎症细胞因子的表

达,同时抑制了软骨基质相关基因的表达，其通过下调TNF-

o/p途径来参与OA进程。动物实验证明，用miR-146抑制

剂治疗的经手术诱导的OA小鼠,通过靶向Camk2d和Ppp3r2

显著减轻了关节软骨的破坏。有研究表明，由软骨细胞分泌 的外泌体中所表达的Wnt5a和Wnt5b通过选择性的Wnt信 号通路激活了 Yes相关蛋白(Yes-associatedprotein, YAP),

增强了软骨细胞的增殖和转移，但却降低了软骨细胞ECM 的分泌。实验证实，SMSC-140-EXOs增强了 ACs的增殖和

迁移，却没有降低ECM的体外分泌的缺点。体内实验进_

步证实，SMSC-140-EXOs可以成功阻止大鼠OA模型疾病 的发生1211 o这些miRNA既存在于EXOs中，同时也参与了

MSCs抑制OA的炎症反应。这是促进关节软骨修复改善OA

的潜在策略1221 o2.4不同细胞来源的外泌体对骨性关节炎的影响关节滑膜炎症和血管生成是OA发病的重要因素。有实 验表明，用在IL-邛刺激下的人滑膜成纤维细胞(synovial

fibroblasts, SFB)分泌的外泌体可以诱导软骨细胞OA样基

因表达模式的改变和软骨降解画。与没有被IL-邛刺激的

SFB相比，使用IL-ip刺激SFB后分泌出的外泌体可以使软

骨细胞中的MMP-13和ADAMTS5的表达显著上调，并且

下调了 COL2A1和ACAN。Nanostring分析表明，IL-甲刺

激下的SFB与未刺激的SFB分泌的外泌体中有50种miR-

NAs的表达水平存在差异。这说明SFB可能通过刺激关节

软骨的基因表达来促进血管生成，从而参与血管生成。Gasado等研究发现，利用来源于骨髓间充质干细胞的

外泌体(BMSC-EXOs)作用于猪的抗炎滑膜炎模型，发现

其最终可以使动物模型中滑膜淋巴细胞减少，抑制T细胞

分泌TOF-ao动物模型上的的动力学步态分析，如摆动时

间、步长时间和姿态持续时间等参数也较之前有所改变，说

明了 BMSC-EXOs在疾病中起到了免疫调节的作用1241 o另有研究比较了诱导的多能干细胞来源的间充质干细胞

(induced pluripotent stem cell-derived MSCs, iMSC)和 SMMSCs两种细胞来源的EXOs对OA的治疗作用效果，实

验表明，注射iMSC-EXOs和SMMSC-EXOs都能减轻小鼠

OA模型的疾病发生，但iMSC-EXOs的治疗效果要优于 SMMSC-EXOs B5Io Gibson 等閃证明了 BMP-2 和 Wnt-5a

预处理的ESC来源的EXOs能促进大鼠软骨缺损的修复。

Wang等也进行了类似的实验，他们发现向关节内注射ESC-

MSCs可减轻DMM模型软骨破坏和基质降解。进一步的体

外研究表明，这种作用是通过ESC-MSCs分泌的EXOs发 挥作用的。EXOs通过增加II型胶原合成和降低ADAMTS5

的表达来维持软骨细胞表型阿。SMMSCs来源于滑膜，具有较高的自我更新能力，因

为滑膜和关节软骨在滑膜关节发育过程中由共同的细胞群发

育而来，因此SMMSCs比其他MSCs与软骨细胞的关系更

加密切。研究显示，SMMSCs比BMSCs和AMSCs更适合

用于软骨修复，体外实验表明，SMMSC-EXOs能显著促进 软骨细胞的迁移和增殖閃。但其也有缺点，在小鼠OA模

型中，SMMSC-EXOs处理过后的软骨表面不平整，蛋白多

糖丢失，浅表区的软骨消失，而用iMSC-EXOs处理软骨时

未发现上述情况。更重要的一点是，iMSCs的获取途径可由 非侵入性方法获取，而滑膜SMMSCs的获取过程需要进行

创伤性的手术。移植患者特定的iMSC-EXOs可以避免一些 伦理方面的问题和免疫抑制相关的潜在问题，并且来源广

泛，取之不尽，可以满足临床需要。3小结与展望目前，对于治疗OA的EXOs疗法还处于临床实验阶 段，MSC还没有被正式批准用于OA。但有600多项研究已 经证实使用MSC来治疗OA是安全的，而对MSCs-EXOs

的深入研究势必会改变现有的OA的细胞疗法，解决许多与 使用活细胞作为治疗药物的有关难题，如免疫排斥反应，因

为EXOs具有最小的免疫原性和毒性迅 而且，使用EXOs 药物治疗这种方式更易被人们所接受。因为这种细胞外囊泡

是人本身身体生理所具有的，它们可以通过一些非侵入性的

途径，比如口服摄入、鼻腔黏膜给药，甚至可以吸入给药。

EXOs药物更适合商品化，我们可以通过基因操作来选择外

泌体的来源细胞，从而生产具有无限繁殖潜力的克隆细胞

系，来确保可再生的成本效益囱。然而，在软骨修复这个

方面，利用EXOs治疗OA仍有一些问题亟待解决，如向关 节腔内注射EXOs后对关节腔内EXOs的分布情况和清除速

率如何进行准确的评估目前尚未研究透彻，但不管怎样，

EXOs未来在治疗OA的地位肯定会呈指数般上升。参考文献[1]

Sacitharan PK, Vincent TL. Cellular ageing mechanisms in oste­

2019年 10月第16卷第5期生物骨科材料与临床研究Orthopaedic Biomechanics Materials And Clinical Study.63.oarthritis[J]. Mamm Genome, 2016, 27(7-8): 421-429.[2]

Whiteside TL. Exosomes and tumor-mediated immune suppression]J].

J Clin Invest, 2016,126(4): 1216-1223.[3]

Zhang J, Li S, Li L, et al. Exosome and exosomal microRNA: traf­

ficking, sorting, and fimction [J], Genomics Proteomics Bioin- fbrmatics, 2015, 13(1): 17-24.[4]

Cosenza S, Ruiz M, Toupet K, et al. Mesenchymal stem cells derived exosomes and microparticles protect cartilage and bone from degrad­ation in osteoarthritisfJ]. Sci Rep, 2017,7(1): 16214.[5] Lobb RJ, Becker M, Wen SW et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J]. J Ex­tracell Vesicles, 2015,4(1): 27031.[6]

Sharma P, Ludwig S, Muller L, et al. Immunoaffinity-based isola­tion of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients

with melanoma!J]. J Extracell Vesicles, 2018, 7(1): 1435138.[7]

Mtwer KW, Buzas El, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle

research [J]. J Extracell Vesicles, 2013,2(1): 1-25.[8]

Vergunst CE, van de Sande MG, Lebre MC, et al. The role of chemokines in rheumatoid arthritis and osteoarthritisfJ]. Scandi­

navian journal of rheumatology, 2005,34(6): 415-425.[9]

Domenis R, Zanutel R, C 聊onnetto F, et al. Characterization ofthe Pro- inflammatoiy Profile of Synovial Fluid-Derived Exosomes of Patients

with Osteoarthritis[J]. Mediators Inflamm, 2017,2017(1): 4814987.[10] Assirelli E, Pulsatelli L, Dolzani RetaL Human osteoarthritic cartilage sho­

ws reduced in vivo expression ofIL-4, a chondroprotective cytokine

that differentially modulates IL-1 beta-stimulated production of chemokines and matrix-degrading enzymes in vitro[J]. PLoS One, 2014,9(5): e96925.[11] Alaaeddine N, Antoniou J, Moussa M, et al. The chemokine CCL20 induces proinflammatoiy and matrix degradative responses in carti- lage[J]. Inflammation research: official journal ofthe European His­tamine Research Society, 2015,(9): 721-731.[12] Troeberg L, Nagase H. Proteases involved in cartilage matrix de­

gradation in osteoarthritisfJ]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1824:(1) 133-145.[13] Kaspiris A, Khaldi L, Chronopoulos E, et al. Macrophage-specific

metalloelastase (MMP-12) immunoexpression in the osteochondral

unit in osteoarthritis correlates with BMI and disease severity[J]. Pathophysiology : the official journal of the International Society

for Pathophysiology, 2015,22(3): 143-151.[14] Wang y YuD, Liu Z, et al. Exosomes from embryonic mesenchy­

mal stem cells alleviate osteoarthritis through balancing synthesis and degradation of cartilage extracellular matrixfj]. Stem Cell Res

Ther, 2017, 8(1): 1.[15] Zhang S, Chu WC, Lai RC, et al. Exosomes derived from human

embryonic mesenchymal stem cells promote osteochondral re-

generation[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2016,24(12): 2135-2140.[16] Qing L, Lei P, Liu H, et al. Expression of hypoxia-inducible fac­

tor-1 alpha in synovial fluid and articular cartilage is associated

with disease severity in knee osteoarthritis [J]. Exp Ther Med,

2017,13(1): 63-68.[17] 肖大伟.突变型低氧诱导因子修饰骨髓间充质干细胞来源的

外泌体联合软骨再生支架治疗家兔早期软骨缺损[J].中华实验

外科学杂志,201& 5(5): 888-1.[18] Toh WS, Lai RC, Hui JHP, et al. MSC exosome as a cell-free MSC

therapy for cartilage regeneration: Implications for osteoarthritis

treatment[J]. Semin Cell Dev Biol, 2017, 67: 56-.[19] Hou C, Zhang Z, Zhang Z, et al. Presence and function of micro-

RNA-92a in chondrogenic ATDC5 and adipose-derived mesen­chymal stem cells[J]. Mol Med Rep, 2015,12(4): 48力-4886.[20] Meng F, Zhang Z, Chen W, et al. MicroRNA-320 regulates matrix

metalloproteinase-13 expression in chondrogenesis and interleu­

kin- 1 beta-induced chondrocyte responses[J]. Osteoarthritis Carti­

lage, 2016,24(5): 932-941.[21] Tao SC, Yuan T, Zhang YL, et al. Exosomes derived from

miR-140-5pverexpressing human synovial mesenchymal

stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model[J] .Theranostics, 2017,

7(1): 180-195.[22] Zhang X, Wang C, Zhao J, et al. miR-146a facilitates osteoarthritis

by regulating cartilage homeostasis via targeting Camk2d and

Ppp3r2[J]. Cell Death Dis, 2017, 8(4): e2734.[23] Kato T, Miyaki S, Ishitobi H, et al. Exosomes from IL-1 beta stimu­

lated synovial fibroblasts induce osteoarthritic changes in articular

chondrocytesfJ]. Arthritis Res Ther, 2014,16(4): R163.[24] Casado JG, Blazquez R, Vela FJ, et al. Mesenchymal Stem Cell-

Derived Exosomes:Immunomodulatory Evaluation in an Antigen- Induced Synovitis Porcine Model [J]. Front Vet Sci, 2017,4: 39.[25] Zhu Y Wang X Zhao B, et al. Comparison of exosomes secreted

by induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells

and synovial membrane-derived mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritisfJ]. Stem Cell Res Ther, 2017, 8(1): .[26] Gibson JD, O'Sullivan MB, Alaee F, et al. Regeneration ofArticu­

lar Cartilage by Human ESC-Derived Mesenchymal Progenitors

Treated Sequentially with BMP-2 and Wnt5a[J]. Stem Cells Tran- sl Med, 2017, 6(1): 40-50.[27] Kojima R, Bojar D, Rizzi G, et al. Designer exosomes produced by

implanted cells intracerebrally deliver therapeutic cargo for Parkin- son's disease treatment[J]. Nat Commun, 2018,9(1): 1305.[28] He M, Zeng Y. Microfluidic Exosome Analysis toward Liquid Bi­

opsy for Cancer[J]. J Lab Autom, 2016, 21(4): 599-608.[作者简介]王继锋(1993・)男，硕士，住院医师。研究方向:运动医学。*[通信作者]王大平(1962-)男，博士，主任医师。研究方向:运动医学。(收稿日期:2018-05-02)