显微技术

荧光显微技术在细胞生物学中的应用

摘要：细胞是生命活动的基本单位，是展现活的生命状态全部特点的最小单元。一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找。但是由于细胞体积微小，细胞内组分微量而复杂，涉及的生化反应非常迅速，使得细胞研究尤其是单个活细胞的研究具有很大的难度。利用荧光显微技术，并结合其它一些生物实验技术对细胞的一些生命活动进行研究。本文主要介绍了荧光显微技术再细胞生物学中的应用。

关键词：细胞；生化反应；荧光显微技术。

显微技术是细胞学中最基础的研究手段之一。它直观、立体，一直是观测细胞形态、结构和生命现象的有力工具。RobertHooke首先运用自制显微镜观察到栎树皮具有的细胞结构。在此后的300多年里，各种显微技术在细胞研究中得到了广泛的应用。最早发展起来的可见光显微镜将人们引入到一个以前一无所知的单细胞世界，后继发展起来的暗视野显微镜、相差显微镜和微分干涉显微镜可以观察到较大细胞器及其运动，到电镜、扫描探针显微镜对细胞超微结构、表面粗糙度和纳米结构等生动直观的研究，以及结合活体染色或荧光染色可以对核酸、蛋白质和一些酶或受体等生物大分子进行定位观察。显微技术在空间分辨率、检测灵敏度、图像与数据的记录和处理等方面获得了长足的发展[1]。

分子发射荧光的机制：当物质分子吸收某些特征频率的光子以后，可由基态跃迁至第一或第二电子激发态中的各个不同振动能级和各个不同转动能级。处于激发态的分子通过无辐射弛豫（例如与其它分子碰撞过程中消耗能量或者诱发光化学反应而消耗能量等）降落至第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这个最低振动能级以辐射弛豫的形式跃迁到基态中各个不同的振动能级，发出分子荧光，然后再无辐射弛豫至基态中最低振动能级。

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在细胞中，一些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发射荧光，这种荧光称为自发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光探针标记后，经紫外线照射亦可发荧光，这种荧光称为继发性荧光。细胞内自发性荧光一般都很微弱，且易被漂白，难以检测。荧光显微技术多是利用荧光标记技术使某些特定成分产生继发性荧光，对细胞进行研究。荧光探针可以将活细胞的光学特性与生物学特性紧密的联系起来，对研究细胞结构、生理行为、物理化学特性极为重要。目前荧光探针技术已发展得相当完善，利用目前已达上千种与细胞内不同分子（或离子）特异性结合的荧光探针，人们就可以直接观测活细胞中各种重要生物分子的位置、运动以及与其它分子的相互作用，如对细胞器、细胞膜元素的运动、细胞膜电位、离子浓度、酶活性和基因转移等进行有效的观测。荧光显微技术的特点与优势在于：1、特异性好，灵敏度高，有极高的空间和时间分辨率及精确度；2、对样品的处理环节少，甚至可实现样品的近真实环境探测，对样品的损伤小；3、直观、快速，信息量大，可提供从紫外到红外范围的图像信息[2]；4、应用范围广，在生物学研究、医学诊断与治疗、农业、环保、加工制造等领域都有广泛应用。荧光显微技术目前已经成为在光镜水平对特异蛋白质、DNA等生物大分子在细胞中定性定位的最有力的工具，被广泛的应用于研究生物分子间相互作用，亚细胞水平的光学成像以及相关的组织光学等。

一、光学显微原理

光学显微是借助于光所形成的像来观察和研究物体细微结构的。普通的光学显微镜主要由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。

光学显微镜的放大原理：显微镜之所以能将被检测物体放大，是通过透镜来实现的。被检测物AB放在物镜下方的1~2倍焦距之间，则在物镜后方形成一个倒置的放大实像

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A1B1，这个实像正好位于目镜的焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像A2B2，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛明视距离处，即25cm，使所看到的物体最清晰，也就是说虚像A2B2是在眼球晶状体的两倍焦距之处，在眼球后在视网膜形成一个倒立的A2B2缩小像凡A3B3。光学显微镜的放大率：显微镜的放大率也称放大倍数。显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜的放大倍数的乘积。学显微镜的分辨率：显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显

微镜的分辨率有关.分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨率的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率[3]，由于制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。可见光的最短波长为0.4微米，光学显微镜最大的分辨率为0.2微米。微镜的焦点深度：显微镜调焦到能看清楚标本的某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚，能看清楚的这两侧的厚度叫做焦点深度。

二、荧光显微镜

荧光显微镜是根据光致发光的原理，利用一定波长的光激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，呈现荧光图像。荧光显微镜的主要特点是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使被观察的标本内的荧光物质获得必要强度的激发光。为了只让某一特定波长的激发光照射在标本上，必须在激发光源与显微镜之间的光路中安装激发滤光片，让激发光源的特定波长的光通过，作为激发光，样品吸收这一激发光后便会产生发射荧光。为了得到单一的荧光，还需在物镜和目镜之间的光路中安装一吸收滤光片，它能将样品吸收后剩余的激发光吸收掉，并且它能有选择性的让某一特定波长的荧光通过，而把其它非专一性的可见光挡住不让通过，从而得到理想的荧光图像。

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荧光显微镜成像的对比度好、反差强，一般都是利用荧光的强度、分布的变化来反应细胞内物质、离子的分布和变化。因此细胞荧光图像可以用于分析细胞内部的物质组成、结构特征和细胞生理过程中物质分布的变化。将荧光显微镜和CCD方法结合，可以观察荧光标记的受体在细胞表面的运动；利用绿色荧光蛋白及其衍生物研究细胞内反应动力学、原位跟踪细胞的运动、选择性的杀死被绿色荧光蛋白表达的细胞；通过检测标有荧光物质的蛋白质、多肤、抗体、激素等生物大分子，来研究活细胞的结构，研究细胞内生物大分子之间的相互作用及其原理。Chrisoph Brauchle等人还利用荧光显微镜实时跟踪观察了Cy5修饰的单个AAV病毒感染单个活的Hela细胞的整个过程，包括单个AAV病毒在溶液中扩散、接触细胞表面、穿过细胞膜、在胞浆中扩散、穿过细胞核膜以及在细胞核中扩散运动轨迹的全过程跟踪观察[4]。

但是，由于普通的荧光显微镜客观上存在着球面误差，其分辨率较低，使得直观分析荧光进行亚细胞定位较为困难，还需要结合图像区域性荧光定量分析技术、图像处理技术辅助进行，方法较为复杂。除此之外，普通的荧光显微镜需要采用能量较高的紫外或可见光激发荧光物质发出荧光，这样一方面易导致荧光探针过早碎灭而使定量分析产生误差，另一方面会造成细胞损伤。

三、激光扫描共聚焦显微技术

1957年Minsky在他的专利中首次阐明激光共聚焦扫描显微技术的基本原理，1985年Wiijanedts第一次成功的用激光共聚焦扫描显微镜演示了荧光标记的生物材料的光学横断面，至此激光共聚焦扫描显微镜的关键技术已基本成熟。激光共聚焦扫描显微镜在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，用激光束作扫描光源，经光源针孔形成点光源，经过分光镜和物镜后聚焦于样品上。对样品内焦平面上进行逐点扫描的结果汇聚在检测针孔处成像，再由检测针孔后的光电倍增管或电感祸合器件逐点逐线快速扫描成像。由于照

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明针孔和检测针孔相对于物镜焦平面是共扼的[5]，只有样品焦平面上的光才能经检测针孔到达检测器，而焦平面上下的光则完全被阻挡在检测针孔两边，从而产生了一个光学切片，这就是共聚焦的基本原理和概念。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响[6]。系统经一次调焦，扫描在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，因而能够获得较厚样品的高质量的三维图像，从而能够对活细胞直接进行无损伤立体研究。且由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

激光共聚焦扫描显微镜己成为活细胞结构和细胞生理行为研究中重要的检测和分析工具。利用激光共聚焦扫描显微镜可以对亚细胞进行荧光定位研究：Trivedi等人就应用激光共聚焦扫描显微镜双标记技术研究Pc4在小鼠淋巴细胞LY-R中的亚细胞定位[7]，成功的探测到Pc4在18h内的亚细胞空间分布变化情况;还可以对标记细胞进行共聚焦扫描荧光定量分析，准确检测抗原表达，荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特征研究：Jaggar J.H.等采用激光共聚焦扫描显微镜快速动态成像，结合新型细胞荧光探针如Fluo-3等，测定细胞内Ca2+的时空聚散涨落分布以及在刺激条件下的动态含量变化等。激光共聚焦扫描显微技术还可以用于得到完整的、活的或固定的细胞及组织的系列“光学切片”，测定这些“光学切片”的物理、生物化学特性的变化[8]，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些特性的动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析，从而对细胞动力学研究有着重要的意义。通过光学切片，将样品的三维数据经过图像处理，可获得样品的三维立体结构，从而具有观察空间结构的独特特点，对检测样品从表层、单层、静态、局部的观察进展到立体、断层扫描、动态、全面的研究。Manelli-olivera等就根据获得的光学切片图像[9]，分析了正常与癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系。由此可见，激光扫描共聚焦显微镜具有将形态学观察、生理学动态监测核三维图像分析融为一体的“细胞CT”功能，是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广

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泛用于荧光定量测量、细胞膜流动性、三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

但是，激光共聚焦扫描显微镜在应用中也具有一些不足之处：虽然荧光通过入射激光束的锥形照明激发，并且只在焦点处收集荧光，不会造成细胞多层面荧光混叠而使得分辨率较高，但是经过Z轴方向的部分荧光物质仍然会被锥形激光光束激发，使得这些区域被光漂白;探测器小孔则了焦平面上可以探测到的荧光的多少；另外和普通荧光显微镜一样，激光共聚焦扫描显微镜也需要能量较高的紫外线或可见光激发荧光物质，易引起细胞的光损伤[10]。

四、展望

18～19世纪显微技术的发展推动了生物学，特别是细胞学的迅速发展。例如，19世纪后叶细胞学家对受精作用、染色体的结构和行为的研究，就是在不断改进显微技术的过程中取得很大成就的，而这些成就又为细胞遗传学的建立和发展打下了基础。此外，显微技术在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生物学及孢粉学发展中，已成为一个主要研究手段。

电子显微镜的发明促使生物学中微观现象的研究从显微水平发展到超显微水平。超微结构的研究结合生物化学的研究，使以形态描述为主的细胞学发展成为以研究细胞的生命活动基本规律为目的细胞生物学。

20世纪70年代以来，由于电子显微镜分辨率的不断提高并与电子计算机的结合应用，许多分子生物学的现象，例如DNA的转录、DNA分子杂交等在生物化学中用同位素技术可证实的现象[11]，也可在电子图象中获得直观的证实，许多生物大分子的结构和功能也可

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从电子图象的分析中加以认识。总之，利用显微技术进行的生物学研究可以反映细胞水平、超微结构水平，甚至分子水平三个不同的层次的信息。三者各具特点，同时又是相互联系和相互补充的。

在医疗诊断中，显微技术已被用为常规的检查方法，如对血液、寄生虫卵、病原菌等的镜检等。利用显微技术作病理的研究已发展为一门专门的学科——细胞病理学，它在癌症的诊断中特别重要。某些遗传病的诊断，已离不开用显微技术作染色体变异的检查。此外，在卫生防疫、环境保护、病虫害防治、检疫、中草药鉴定、石油探矿和地层鉴定、木材鉴定、纤维品质检定、法医学、考古学、矿物学以及其它工业材料和工业产品的质量检查等方面，都有广泛的应用。

参考文献

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[2] GoeffauA, BarrellB.GnadBusseyH.(1996), Scinece274, 563.

[3] 周璐, 李越中, 李健(1999). 生命科学11(2), 87.

[4] 刘擎, 余龙(2000). 生命的化学2(2), 61.

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[6] 王运吉, 张等花(2000). 细胞生物学中国轻工业出版社, 北京.

[7] 沈萍(2000). 微生物学高等教育出版社, 北京.

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[8] 刘志恒(2002). 现代微生物学科学出版社, 北京.

[9] 周长林(2004). 微生物学中国医药科技出版社, 北京.

[10] 蔡信之, 黄君红(2002). 微生物学高等教育出版社, 北京.

[11] 郭波, 谢佩蓉, 邹强, 郑萍(2002). 生物化学与生物物理进展29(1), 19.

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