受磷蛋白重组腺病毒的制备与鉴定

刘梦娜;汪凯;任安经;章卫平;吕建新

【摘 要】目的 构建含受磷蛋白PLB基因的重组腺病毒载体,为研究受磷蛋白PLB的生物学功能提供工具.方法 将RT-PCR获得的受磷蛋白PLB cDNA克隆至pShuttle-CMV载体,Pme Ⅰ酶切线性化后,电转化至含有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,从而获得重组腺病毒载体,Pac Ⅰ酶线性化该重组载体,转染293细胞进行病毒的包装和扩增,经超离心对重组病毒Ad-PLB进行纯化;测定病毒效价后,体外感染大鼠心肌细胞H9C2,Western blot法验证腺病毒病毒介导的重组PLB蛋白表达.结果 成功构建了重组腺病毒载体,体外包装制备了PLB的重组腺病毒,扩增纯化后的病毒效价达6.25×1010/ml,能有效介导PLB在心肌细胞中的重组表达.结论 过表达受磷蛋白PLB的重组腺病毒载体构建成功,为之后受磷蛋白PLB的相关生物学功能研究奠定了基础. 【期刊名称】《医学研究杂志》 【年(卷),期】2016(045)010 【总页数】6页(P48-53)

【关键词】受磷蛋白;腺病毒;心肌;肌质网 【作 者】刘梦娜;汪凯;任安经;章卫平;吕建新

【作者单位】325035 温州医科大学检验学院、生命科学学院;200433 上海,第二军医大学基础部病理生理学教研室;200433 上海,第二军医大学基础部病理生理学教研室;200433 上海,第二军医大学基础部病理生理学教研室;200433 上海,第二军医大学基础部病理生理学教研室;325035 温州医科大学检验学院、生命科学学院

【正文语种】中 文 【中图分类】R3

受磷蛋白(phospholamban, PLB又简称PLN)是一种存在于肌质网(sarcoplasmic recticulum ,SR)膜上的单跨膜蛋白，含有52个氨基酸残基，主要表达于心肌、平滑肌和慢缩肌等细胞的肌质网中，在不同物种和不同组织中高度同源[1,2]。目前认为，受磷蛋白的一级结构分为两个区域，1个是亲水性区域(细胞质结构域，又分为IA区，包括1～20位氨基酸残基；游离的IB区，21～30位氨基酸残基)，此区域含有磷酸化位点(丝氨酸-16和苏氨酸-17)，能分别有选择的被cAMP依耐的和Ca2+/calmodulin依耐的激酶(calcium/calmodulin-activated kinase Ⅱ,CaMKⅡ)磷酸化；1个是跨膜结构域(疏水结构域，31～52位氨基酸残基)。受磷蛋白正是通过这些磷酸化位点可逆磷酸化来调节肌质网钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase，SERCA2α)的活性，从而影响胞质Ca2+循环，继而调节肌肉的收缩和舒张功能。因此在心肌组织中，PLB结构和功能的改变直接或间接地影响扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)和心力衰竭(hear

failure,HF)等心血管疾病的发生、发展，已逐渐成为临床治疗的潜在靶点。然而，现阶段对PLB生物功能的了解及其活性调节的认识还非常有限。因此本实验室拟构建PLB重组腺病毒，通过体外感染大鼠心肌细胞H9C2验证其过表达成功，为进一步研究受磷蛋白的生物学功能及其网络化调节机制奠定基础。

1.材料：PLB表达载体引物用prime select软件设计。引物测序购自吉尔森公司。pAdEasy-1/BJ5183菌为本实验室自行制备。高糖DMEM细胞培养基、生理盐水购自Hy-Clone公司。细胞培养板购自Corning公司。胎牛血清购自Gibco公司。DNA纯化试剂盒来自Omega公司。转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。性内切酶购自New England Biolabs公司。T4连接酶购

自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen。PLB抗体购自Badrilla公司。GAPDH抗体购自拓然公司。

2.PLB基因表达质粒的克隆与鉴定: 在Pumbmed网站上查询PLBCDS序列，应用prime select软件设计其特异引物(5′-GGGGTACCCCATGGAAAAAGTGCAATAC-3′, 5′-GCTCTAGAGCTCACAGAAGCATCACAATG-3′)，以野生型小鼠心脏cDNA为模板，进行高保真PCR扩增纯化，电泳鉴定条带大小。

3. pShuttle-PLB重组穿梭载体的构建和鉴定：胶回收的PCR电泳纯化片段和pShuttle-CMV载体分别经性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后，T4连接酶16℃水浴连接21h,将连接后产物转化至stable3感受态细菌中，37℃孵育12～16h，挑取大小合适的菌落，质粒小抽得到扩增后的连接载体，性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ酶切电泳鉴定，筛选出目的基因PLBCDS与pShuttle-CMV连接的重组载体。由于PLBCDS序列很短，以所提质粒为模板，用PLBCDS引物为引物，进行PCR扩增反应后，电泳鉴定酶切后的PLBCDS条带。电泳鉴定为阳性质粒经测序确认成功连接后即得到重组的穿梭载体pShuttle-PLB。

4.pAd-PLB重组腺病毒的构建、鉴定和初步扩增：PmeⅠ酶切线性化重组的穿梭载体pShuttle-PLB，过柱纯化后电泳鉴定片段仍在，取13μl纯化后产物采用电穿孔法，500V，10ms，电击10次后转化至预转化有腺病毒骨架质粒的感受态大肠杆菌BJ5183，涂于带有卡那霉素抗性的LB培养基上,37℃孵育，挑取大小合适的单克隆，抽提质粒时，由于重组质粒分子质量>40kb常规质粒小抽法不能提出，故本次实验具体步骤如下:①按照Omega试剂盒抽提步骤进行至加入SolutionⅢ后，13000RCF,离心12min;②取上清约750μl,加入等体积异丙醇，室温

15000r/min,离心10min后;③弃上清，向底部沉淀加入1ml 75%乙醇，震荡使沉淀漂起，室温12000r/min,离心5min后弃上清，再加入1ml 75%乙醇重复上述

步骤;④弃上清晾干沉淀后，加入25μlTE，即得到重组腺病毒载体质粒，PacⅠ酶切鉴定后，最终得到重组成功的腺病毒载体pAd-PLB。在293细胞包装之前，将重组成功的腺病毒质粒先转化至stable3感受态细菌进行初步扩增，PacⅠ酶切鉴定扩增正确后备用。

5.重组腺病毒pAd-PLB的包装和扩增：初步扩增所得重组质粒经PacI线性化后，采用乙醇沉淀法得到线性化后的重组质粒，具体方法为：①酶切产物+1/10体积NaAc(3mol/L,pH5.0)+2.5倍体积无水乙醇;②混匀后-20℃放

置;③4℃,12000r/min,离心15min;④弃上清，向底部沉淀加入1ml 75%乙醇，混匀，将沉淀震起;⑤4℃,12000r/min,离心5min;⑥重复④和⑤;⑦弃上清，晾干，加入30μl ddH2O，备用。按1.0×106/瓶的量将293细胞铺至25cm2培养瓶中，待细胞长至50%左右，依据Lipofectamine2000试剂说明书方法，将PacⅠ酶切线性化后的重组质粒转染至293细胞进行包装，待细胞有50%飘起时，将剩余贴壁细胞吹起，把上清与细胞混合液一起收集起来，转移至15ml离心管中，500RCF，离心5min后，加入1.5ml PBS将沉淀的细胞吹打混匀，-80℃冻存，观察病毒完全冻住后，至于37℃化冻后及时取出震荡1min，再冻于-80℃，按此方法-80℃和37℃反复冻融共3次，释放腺病毒。分装后进行效价测定后，反复3次感染293细胞，从而得到更高效价的腺病毒。

6.重组腺病毒pAd-PLB的纯化：在最后扩增的病毒上清液中加入0.5倍体积的20% PEG8000/2.5mol/L NaCl,4℃沉淀36～48h，混合液转移至40ml离心管，4℃，5000r/min,离心15min后，6ml PBS重悬沉淀，加入3g CsCl(0.5g/ml)混匀，4℃，10000r/min,离心30min后取下层液体(注意勿吸到上层蛋白)，测比重=1ml液体质量/1ml(提前测好PBS比重及1gCsCl溶于1ml PBS中所加体积)，用PBS和CsCl调整比重至1.34～1.36g/ml(1.35g/ml最佳)后转移至超离管中，上层加入2ml左右石蜡油覆盖，20℃,4100r/min,超离20h。用5ml注射器穿刺

收集石蜡油下约2.5cm处白的病毒带(勿超过1ml)，冰上放置。透析脱盐后-80℃保存。

7.重组腺病毒pAd-PLB的效价测定：按2.5×105/孔的293细胞量铺至24孔板，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养待细胞铺满孔板时，按梯度加入一定量的重组腺病毒，观察细胞生长状态，细胞全飘起孔所加病毒体积记为V。当MOI值等于10时，即为病毒的实际量。因此按照公式计算病毒效价=10×每孔细胞数/V。 8.重组腺病毒pAd-PLB的鉴定：将大鼠心肌细胞H9C2按0.6×105/孔的量接种至24孔板，待细胞长至70%左右，按MIO值50、100、200、400的梯度病毒量分别加入含有腺病毒pAd-PLB和对照腺病毒Ad-GFP的无血清培养基。12h后更换为含有10%FBS的有血清培养基，48h后收细胞。每孔加50μlRIPA细胞裂解液(1∶100加入蛋白酶抑制剂)常规方法制备蛋白样品。经BCA法定量后每孔取40μg用15%SDS-PAGE分离蛋白电泳，275mA,恒流，室温转膜45min,5%脱脂奶粉封闭1h后，将膜按蛋白分子质量大小裁成两份，与一抗PLB(1∶5000)，二抗兔抗鼠IgG(1∶5000)杂交，同时GAPDH为内参，分别与一抗

GAPDH(1∶10000)，二抗兔抗鼠IgG(1∶5000)杂交，其中，一般一抗杂交条件为4℃，12～16h,二抗为室温，1～2h。ECL法显影检测PLB蛋白和GAPDH含量。

1.PLB目的基因的扩增：以野生型小鼠心脏cDNA为模板，采用高保真PCR法扩增得到PLBCDS目的片段，电泳鉴定170bp左右处有1个条带，与预期相符，证明目的条带扩增正确(图1)。

2.pShuttle-PLB重组穿梭载体的构建和鉴定：KpnⅠ和XbaⅠ双酶切目的基因PLB和pShuttle-CMV，电泳鉴定片段均在，分别为170bp左右和7400bp左右。经T4连接酶连接过夜，挑取其中8个大小合适的菌落，经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切连接后的载体来筛选阳性克隆时，电泳鉴定只能得到载体片段，大小约7400bp。

以所提质粒为模板，用PLBCDS引物为引物，进行PCR反应，电泳鉴定在170bp处有条带出现，选取相应单克隆测序结果，如图2所示，从第20个碱基到第178个碱基为PLBCDS序列，所测目的基因序列与pumbmed提供PLBCDS序列完全匹配，提示目的基因PLBCDS序列与pShuttle-CMV载体连接正确。 3.pAd-PLB重组腺病毒载体的构建和鉴定：PmeⅠ线性化该重组穿梭载体pShuttle-PLB与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组，将得到的重组腺病毒质粒pAd-PLB经PacI酶切鉴定，可见3kb和30kb的片段，提示同源重组成功(图3)。

4.重组腺病毒载体pAd-PLB的包装及效价测定：用Lipofectamine2000转染试剂将线性化后的pAd-PLB转染至293细胞，转染7天后，培养基略黄，镜下出现comet-like plaques现象。转染11天后，细胞有50%飘起时,收集细胞，于-80℃和37℃水浴反复冻融3次，释放腺病毒，最后检测病毒效价为5×1010/ml。氯化铯超速离心后可见白色病毒条带。穿刺抽出病毒条带并透析去盐后，检测病毒效价为6.25×1010/ml。

5.重组腺病毒载体pAd-PLB的表达检测：经Western blot法检测，发现感染重组腺病毒pAd-PLB的大鼠心肌细胞H9C2可表达 PLB蛋白，且其表达蛋白的水平随着MOI值的增加而增高，而感染对照Ad-GFP病毒的细胞未检测到PLB病毒的表达。提示我们构建的重组腺病毒在离体培养的细胞中能成功表达目的蛋白PLB(图4)。

PLB最早从心脏微粒体中提取，在空间位置上，与SERCA2α非常接近，是cAMP依赖蛋白激酶的主要底物和SERCA2α的主要调节蛋白，和SERCA2α共同心肌SR对Ca2+的吸收[3～5]。PLB对SERCA2α的活性的调节可以通过外部(β-肾上腺素能受体的激活使其磷酸化)和内部(细胞内Ca2+浓度增加)的改变来实现，同时，PLB作为一个中间桥梁，也成为其他物质调节SERCA2α活性的靶点，如心室

肌细胞中内质网/肌质网Ca2+的感受器——基质交感分子，它就是通过结合于PLB上调节SERCA2α活性的稳态[6]。一般情况下，当PLB与SERCA2α结合后，会抑制SERCA2α的活性，降低其与Ca2+的亲和力；磷酸化后则从SERCA2α的结合位点上移开，抑制作用解除，SERCA2α对Ca2+的亲和性提高，从而调节心肌的收缩和舒张。

已有研究表明，SERCA2α/PLB复合体是心肌收缩的主要调节体，负责转运人体心脏70%的Ca2+，SERCA2α和PLB的突变及Ca2+的不正常转运都会引起收缩功能紊乱和心脏疾病[7～10]。因此，SERCA2α和PLB的靶向治疗已成为心血管疾病，尤其是心力衰竭(heart failure，HF)的重要手段之一。

为了研究PLB在心血管疾病的发生、发展中所起的作用，早在1994年，Luo等[11]建立PLB靶向敲除的转基因小鼠，发现PLB敲除小鼠与野生型小鼠相比，在心率、体重、心重上没有明显差异，但敲除小鼠的心脏收缩功能增强，且对β-肾上腺素的激活无反应性。提示，PLB可能作为β-肾上腺素的下游蛋白，对心肌收缩起抑制作用[12]。当PLB长期抑制或者慢性抑制SERCA2α，心肌细胞收缩会消失，从而导致小鼠和人出现DCM[10]。在人遗传性扩张型心肌病中，已发现3种PLB的突变形式，即Arg9(精氨酸)被Cys(半胱氨酸)替换，Arg14缺失和

Leu39(亮氨酸)的密码子TAA被替换成TGA导致39位亮氨酸编码终止[13～15]。以上可知PLB的直接缺失、抑制和突变都会影响心肌的功能。

在近期的研究中还发现，脯氨酸羟化酶蛋白2和脯氨酸羟化酶蛋白3(PHD2和PHD3)作为1种氧气传感器，在心脏中高表达，可通过羟化一系列蛋白来调节细胞的各种生命活动，它们的缺失可以降低PLB的表达，继而持续激活CaMKⅡ，从而使小鼠对慢性β肾上腺素引起的心肌损伤敏感度增高，最终发展成心力衰竭[16]。可见，大量实验表明PLB直接或间接的改变，是DCM和HF发生的重要因素之一。相应地，在研究者所构建的病理模型中，PLB的表达也出现异常，如

Badu等[17]曾经用结扎小鼠主动脉的方法构建心力衰竭模型，发现PLB蛋白表达明显降低。

目前对于PLB的研究手段有很多种，除了之前提到的应用基因敲除小鼠，还有应用靶向PLB的核酸适配体[18]。另外，研究者用腺相关病毒(adeno-associated vectors，AAV)介导shRNA转入心脏，从而降低PLB的表达，结果PLB的mRNA和蛋白的表达均降低。但这种方法不可避免地引起一些心脏毒性反应，这可能和影响了内源性microRNA的稳态有关。本实验采用AdEasy-1腺病毒系统将PLB基因连接到腺病毒骨架上，成功构建出过表达PLB基因重组腺病毒。重组腺病毒作为一种复制缺陷病毒为基因治疗提供了有力手段，近年来已被广泛应用，其优点在于能在细胞，包括未细胞和组织中高表达目的蛋白。而选择AdEasy-1系统，主要是因为它作为一种E1和E3双缺失的载体系统，相对于AdEasy-2E1、E3和E4 3个位点缺失系统来说可产生更高的病毒效价。与非病毒载体相比，重组腺病毒载体还具有转染效率高、靶向性高、安全性好、稳定性高的特点，是目前基因修饰的首选载体之一。

笔者构建的过表达PLB的腺病毒载体正是利用了这些优点，经酶切、PCR，Western blot法的检测证实重组腺病毒载体pAd-PLB构建正确无误，PLB基因可以正常的转录翻译，且感染大鼠心肌细胞H9C2也证实PLB可以正常表达蛋白，明确了pAd-PLB构建成功，为进一步在体内外实验中研究PLB基因的功能奠定了基础。

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